Введение
- AFLP является технологией молекулярного маркера ДНК, которая обнаруживает полиморфизм ДНК, ограничивая длину фрагментов, продуцируемых ограничительными эндонуклеатами.
- Основные характеристики техники AFLP - это:
- Требует небольшого количества ДНК для анализа, Только 0,5 г.
- Демонстрирует хорошую воспроизводимость.
- Демонстрирует сильный полиморфизм.
- Предлагает высокое разрешение.
- Не требует южной гибридизации.
- Подходит для широкого спектра образцов.
- Устанавливает стабильную наследственность.
- С точки зрения технических функций, AFLP - это продукт, объединяющий RAPD и RFLP.
- Это преодолевает недостатки сложности и радиоактивных опасностей технологии RFLP, и нестабильность и доминирование генетических маркеров в RAPD при включении сильных сторон обеих сторон.
- В последние годы, Эта технология постоянно улучшалась и разработана, Сделать AFLP быстро стать наиболее эффективным молекулярным методом на сегодняшний день.
Принцип AFLP
- AFLP также является технологией ДНК -молекулярного маркера, которая обнаруживает полиморфизм ДНК, ограничивая длину фрагментов, продуцируемых эндонуклеатами ограничения..
- Однако, AFLP включает в себя усиление фрагментов вырезанных ферментов через ПЦР реакция первой, а затем электрофоры с амплифицированными фрагментами вырезанных ферментов в геле секвенирования с высоким разрешением с высоким разрешением. Полиморфизм обнаруживается на основе различной длины амплифицированных фрагментов.
- В эксперименте, Фрагменты вырезания фермента сначала лигируются с искусственными адаптерами, содержащими совместимые сплоченные концы. Последовательность этих сплоченных целей, наряду с последовательности адаптера, служит сайтом связывания для последующих реакций ПЦР.
- В зависимости от требований, разные праймеры с 1 к 3 Селективные нуклеотиды, добавленные на концах, могут быть использованы для достижения селективного усиления. Эти селективные нуклеотиды позволяют праймерам выборочно распознавать фрагменты вырезанных ферментов со специфическими последовательностями спаривания, приводя к конкретному усилению.
Реагент, используемый в тесте
| Экспериментальные реагенты | Описание |
|---|---|
| Taq Enzyme | ДНК-полимераза |
| ЭКОРИ/MSEI Адаптеры | Адаптеры рестрикции |
| E+праймеры | Праймеры для усиления ПЦР |
| M+C Праймеры | Праймеры для усиления ПЦР |
| T4 ДНК -лигаза | ДНК -лигаза фермент |
| E и M Олигонуклеотиды | Олигонуклеотиды для ПЦР |
| Агароза | Гелевая матрица для электрофореза |
| Аммоний Персельфат | Катализатор гелевого литья и денатурации ДНК |
| Акриламид | Компонент гелевой матрицы для секвенирования высокого разрешения |
| Мочевина | Денатурирующий агент для электрофореза |
| Серебряный нитрат | Окрашивание для визуализации ДНК -полос |
| Формамид | Денатурирующий агент для гелей секвенирования ДНК |
| дНТФ | Дезоксинуклеотидные трифосфаты для ПЦР |
| Ксилол цианол | Отслеживание красителя для электрофореза |
| Уксусная кислота | Используется в подготовке геля |
| Стеклянный силан | Агент покрытия для стеклянных пластин в гелевом электрофорезе |
| 50BP отметки | ДНК маркер 50 Пары оснований для ссылки по размеру |
Экспериментальная процедура
1. Экстракция и очистка геномной ДНК
Обратитесь к методам извлечения ДНК.
- Электрофорез фрагментов ДНК на 0.8% агарозный гель (содержащий 0,5 мкг/мл бромида этидия, EB), выиграть 1/3 экстрагированной геномной ДНК для очистки.
- Во-первых, пополнить объем извлеченной ДНК с помощью TE Buffer до общего объема 50 мкл.
- Экстракт один раз с фенолом/хлороформом/изоамиловым спиртом (25:24:1) и однажды с хлороформом/изоамиловым спиртом (24:1). Центрифуга и передача супернатанта в трубку Эппендорфа.
- Добавлять 1/10 объем NAAC и вдвое больше объема абсолютного этанола перед охлаждением, и поместите на -20 ° C, по крайней мере, 2 часы. Центрифуга в 10 000 г для 10 минуты.
- Дважды промойте осадок ДНК 70% спирт этиловый, воздух сухой, и растворить в 30 мкл TE Buffer.
- Значения A260 и A280 с использованием UV-2401PC (Shimadzu) УФ -спектрофотометр для количественной оценки.
- Электрофорез фрагментов ДНК на 0.8% агарозный гель (Содержит 0,5 мкг/мл EB) для определения размера.
Примечание:
- Для ткани 0,1-0,2 г, растворить в растворе 100 мкл E. Для 0,5 г ткани, увеличить раствор E до 300 мкл. В этот момент, Концентрация ДНК составляет приблизительно 100 нг/мкл.
2. Ограничение пищеварение ферментов и лигирование
В 0,2 мл центрифужной трубки, добавлять:
- Приблизительно 250 -нг матричная ДНК,
- 2.5мкл 10 × буфер с пищеварением ферментов.,
- 2.5мкл 10 × T4 ДНК -лигаза буфер,
- 5 Единицы ECORI,
- 5 Единицы MSEI,
- 2 единицы ДНК -лигазы T4,
- 50PMOL MSEI Adapter,
- Двойная дистиллированная вода до общего объема 25 мкл.
Инкубировать смесь в ПЦР -термоциклере, установленном при 37 ° С в течение ночи. После пищеварения, инактивировать ферменты путем инкубации при 65 ° С для 20 минуты. Храните реакцию при -20 ° C для дальнейшего использования в качестве шаблона предварительной амплификации.
3. Предварительное усиление
Возьмите 3 мкл расщепленного фермента и лигированного продукта и добавьте:
- 75e+a primer,
- 75из праймера M+C,
- 15ММ МГ2+,
- 25мм dntps,
- 1 единица Taq-полимераза,
- 3мкл буфера 10 × ПЦР,
- Добавить двойную дистиллированную воду до общего объема 30 мкл.
Установите параметры реакции ПЦР следующим образом:
- Начальная денатурация при 94°C для 90 секунды,
- Денатурация при 94 ° C для 30 секунды,
- Отжиг при 56 ° С для 1 минута,
- Расширение при 72 ° С для 1 минута,
- Повторите вышеуказанные шаги для 30 циклы,
- Окончательное удлинение при 72°C для 10 минуты (Использование ПЦР-машина от компании PE).
После реакции, анализировать продукты усиления с помощью электрофореза на 0.8% агарозный гель (Содержит 0,5 мкг/мл EB). Возьмите 3 мкл продукта и разбавьте его 50 раз для дальнейшего использования в качестве шаблона для селективного усиления.
4. Селективное усиление ПЦР
Возьмите 3 мкл разбавленного продукта и добавьте:
- 75избирательного праймера EcoRⅰ,
- 75из селективного праймера Mseⅰ,
- 15ММ МГ2+,
- 25мм dntps,
- 1 единица так -полимеразы,
- 3мкл буфера 10 × ПЦР,
- Добавить двойную дистиллированную воду до общего объема 30 мкл.
Установите параметры реакции ПЦР следующим образом:
- Начальная денатурация при 94°C для 90 секунды,
- Денатурация при 94 ° C для 30 секунды,
- Отжиг при 65 ° С для 1 минута, затем выполнить 13 циклы (уменьшить температуру на 0,7 ° C за цикл),
- Денатурация при 94 ° C для 30 секунды,
- Отжиг при 56 ° С для 1 минута,
- Расширение при 72 ° С для 1 минута, затем выполнить 25 циклы,
- Окончательное удлинение при 72°C для 5 минуты (Использование машины для ПЦР от компании PE).
Первый, анализировать продукты селективного усиления электрофорезом на 0.8% агарозный гель (Содержит 0,5 мкг/мл EB).
5. Гелевый электрофорез
Разделить усиленные продукты, используя 6% Денатурирование полиакриламидного геля (0.5ММ толщина) и 1 × TBE Buffer (Био-рад секвенирование электрофореза).
- Удалить гребень и предварительно заполнить гель при постоянной мощности 140 Вт для 30 Протокол до тех пор, пока температура не достигнет 47-49 ° C. Обязательно вымывайте мочевину из каждой колодцы.
- Для избирательных продуктов усиления, Добавить равный объем буфера загрузки (98% формамид, 10мМ ЭДТА, 0.25% ксилол цианол, 0.25% бромфеноловый синий) и денатура при 94 ° C для 5 минуты (Использование машины для ПЦР от компании PE). После денатурации, быстро поместите на льду до загрузки.
- Загрузить 8 мкл каждого образца в каждую полосу. Изначально, запустить гель при постоянной мощности 100 Вт примерно 2 Протокол, чтобы быстро сосредоточить образцы на дне скважины. Затем приспособитесь к постоянной мощности 60 Вт, Сохранение температуры около 43 ° C, Пока бромфенол синий не достигнет 2/3 расстояния от верхней части геля до стеклянной тарелки. Завершить электрофорез.
6. Серебряное окрашивание
- Фиксационное решение: Добавить 100 мл ледяной уксусной кислоты в 900 мл деионизированной воды или вдвойниллированной воды.
- Окрашивание раствора: Растворить 1G agno3 в 1 л деионизированной воды, затем добавьте 1.5 мл 37% Формальдегид.
- Развивающее решение: Растворить 30G NA2CO3, 1.5 мл 37% Формальдегид, и 2 мг тиосульфата натрия в 1 л деионизированной воды.
- После электрофореза, Поместите стеклянную тарелку с гелем в пластиковый поднос для серебряного окрашивания.
- Фиксация: Добавьте решение для фиксации и осторожно встряхните на шейкер 30 минуты. Зарезервировать решение для фиксации после фиксации.
- Полоскание: Вымыть гель три раза деионизированной водой для 2 минуты каждый раз.
- Окрашивание: Поместите гель в окрашивающий поднос и залейте раствор из окрашивания (хранится при 4 ° C.). Осторожно встряхнуть на шейкер 30 минуты. После полоскания геля деионизированной водой для 10 секунды, Передайте его в развивающемся подносе.
- Разработка: Добавить разработанное решение (хранится при 4 ° C.) и осторожно встряхнуть, пока группы не перестанут расти.
- Завершение: Добавить используемое решение для фиксации с шага 2 и агитировать в течение нескольких минут. Промойте дистиллированной водой в течение нескольких минут после достижения оптимальных результатов.
- После удаления капель воды из геля и стеклянной пластины, Поместите его на Lightbox и сфотографировано с помощью цифровой камеры Nikon.
Краткое содержание
Спасибо за предоставление полной экспериментальной процедуры AFLP! Если у вас есть какие -либо вопросы или нужна дополнительная помощь, Пожалуйста, не стесняйтесь спрашивать нас. Мы рады предоставить поддержку и ответы.
