Что такое АФЛП? Полный принцип и процесс работы

ПФЛП

Введение

  • AFLP является технологией молекулярного маркера ДНК, которая обнаруживает полиморфизм ДНК, ограничивая длину фрагментов, продуцируемых ограничительными эндонуклеатами.
  • Основные характеристики техники AFLP - это:
    • Требует небольшого количества ДНК для анализа, Только 0,5 г.
    • Демонстрирует хорошую воспроизводимость.
    • Демонстрирует сильный полиморфизм.
    • Предлагает высокое разрешение.
    • Не требует южной гибридизации.
    • Подходит для широкого спектра образцов.
    • Устанавливает стабильную наследственность.
  • С точки зрения технических функций, AFLP - это продукт, объединяющий RAPD и RFLP.
  • Это преодолевает недостатки сложности и радиоактивных опасностей технологии RFLP, и нестабильность и доминирование генетических маркеров в RAPD при включении сильных сторон обеих сторон.
  • В последние годы, Эта технология постоянно улучшалась и разработана, Сделать AFLP быстро стать наиболее эффективным молекулярным методом на сегодняшний день.

Принцип AFLP

  • AFLP также является технологией ДНК -молекулярного маркера, которая обнаруживает полиморфизм ДНК, ограничивая длину фрагментов, продуцируемых эндонуклеатами ограничения..
  • Однако, AFLP включает в себя усиление фрагментов вырезанных ферментов через ПЦР реакция первой, а затем электрофоры с амплифицированными фрагментами вырезанных ферментов в геле секвенирования с высоким разрешением с высоким разрешением. Полиморфизм обнаруживается на основе различной длины амплифицированных фрагментов.
  • В эксперименте, Фрагменты вырезания фермента сначала лигируются с искусственными адаптерами, содержащими совместимые сплоченные концы. Последовательность этих сплоченных целей, наряду с последовательности адаптера, служит сайтом связывания для последующих реакций ПЦР.
  • В зависимости от требований, разные праймеры с 1 к 3 Селективные нуклеотиды, добавленные на концах, могут быть использованы для достижения селективного усиления. Эти селективные нуклеотиды позволяют праймерам выборочно распознавать фрагменты вырезанных ферментов со специфическими последовательностями спаривания, приводя к конкретному усилению.

Реагент, используемый в тесте

Экспериментальные реагенты Описание
Taq Enzyme ДНК-полимераза
ЭКОРИ/MSEI Адаптеры Адаптеры рестрикции
E+праймеры Праймеры для усиления ПЦР
M+C Праймеры Праймеры для усиления ПЦР
T4 ДНК -лигаза ДНК -лигаза фермент
E и M Олигонуклеотиды Олигонуклеотиды для ПЦР
Агароза Гелевая матрица для электрофореза
Аммоний Персельфат Катализатор гелевого литья и денатурации ДНК
Акриламид Компонент гелевой матрицы для секвенирования высокого разрешения
Мочевина Денатурирующий агент для электрофореза
Серебряный нитрат Окрашивание для визуализации ДНК -полос
Формамид Денатурирующий агент для гелей секвенирования ДНК
дНТФ Дезоксинуклеотидные трифосфаты для ПЦР
Ксилол цианол Отслеживание красителя для электрофореза
Уксусная кислота Используется в подготовке геля
Стеклянный силан Агент покрытия для стеклянных пластин в гелевом электрофорезе
50BP отметки ДНК маркер 50 Пары оснований для ссылки по размеру

Экспериментальная процедура

1. Экстракция и очистка геномной ДНК

Обратитесь к методам извлечения ДНК.

Очистка ДНК:

  • Электрофорез фрагментов ДНК на 0.8% агарозный гель (содержащий 0,5 мкг/мл бромида этидия, EB), выиграть 1/3 экстрагированной геномной ДНК для очистки.
  • Во-первых, пополнить объем извлеченной ДНК с помощью TE Buffer до общего объема 50 мкл.
  • Экстракт один раз с фенолом/хлороформом/изоамиловым спиртом (25:24:1) и однажды с хлороформом/изоамиловым спиртом (24:1). Центрифуга и передача супернатанта в трубку Эппендорфа.
  • Добавлять 1/10 объем NAAC и вдвое больше объема абсолютного этанола перед охлаждением, и поместите на -20 ° C, по крайней мере, 2 часы. Центрифуга в 10 000 г для 10 минуты.
  • Дважды промойте осадок ДНК 70% спирт этиловый, воздух сухой, и растворить в 30 мкл TE Buffer.
  • Значения A260 и A280 с использованием UV-2401PC (Shimadzu) УФ -спектрофотометр для количественной оценки.
  • Электрофорез фрагментов ДНК на 0.8% агарозный гель (Содержит 0,5 мкг/мл EB) для определения размера.

Примечание:

  • Для ткани 0,1-0,2 г, растворить в растворе 100 мкл E. Для 0,5 г ткани, увеличить раствор E до 300 мкл. В этот момент, Концентрация ДНК составляет приблизительно 100 нг/мкл.

2. Ограничение пищеварение ферментов и лигирование

В 0,2 мл центрифужной трубки, добавлять:

  • Приблизительно 250 -нг матричная ДНК,
  • 2.5мкл 10 × буфер с пищеварением ферментов.,
  • 2.5мкл 10 × T4 ДНК -лигаза буфер,
  • 5 Единицы ECORI,
  • 5 Единицы MSEI,
  • 2 единицы ДНК -лигазы T4,
  • 50PMOL MSEI Adapter,
  • Двойная дистиллированная вода до общего объема 25 мкл.

Инкубировать смесь в ПЦР -термоциклере, установленном при 37 ° С в течение ночи. После пищеварения, инактивировать ферменты путем инкубации при 65 ° С для 20 минуты. Храните реакцию при -20 ° C для дальнейшего использования в качестве шаблона предварительной амплификации.

3. Предварительное усиление

Возьмите 3 мкл расщепленного фермента и лигированного продукта и добавьте:

  • 75e+a primer,
  • 75из праймера M+C,
  • 15ММ МГ2+,
  • 25мм dntps,
  • 1 единица Taq-полимераза,
  • 3мкл буфера 10 × ПЦР,
  • Добавить двойную дистиллированную воду до общего объема 30 мкл.

Установите параметры реакции ПЦР следующим образом:

  • Начальная денатурация при 94°C для 90 секунды,
  • Денатурация при 94 ° C для 30 секунды,
  • Отжиг при 56 ° С для 1 минута,
  • Расширение при 72 ° С для 1 минута,
  • Повторите вышеуказанные шаги для 30 циклы,
  • Окончательное удлинение при 72°C для 10 минуты (Использование ПЦР-машина от компании PE).

После реакции, анализировать продукты усиления с помощью электрофореза на 0.8% агарозный гель (Содержит 0,5 мкг/мл EB). Возьмите 3 мкл продукта и разбавьте его 50 раз для дальнейшего использования в качестве шаблона для селективного усиления.

4. Селективное усиление ПЦР

Возьмите 3 мкл разбавленного продукта и добавьте:

  • 75избирательного праймера EcoRⅰ,
  • 75из селективного праймера Mseⅰ,
  • 15ММ МГ2+,
  • 25мм dntps,
  • 1 единица так -полимеразы,
  • 3мкл буфера 10 × ПЦР,
  • Добавить двойную дистиллированную воду до общего объема 30 мкл.

Установите параметры реакции ПЦР следующим образом:

  • Начальная денатурация при 94°C для 90 секунды,
  • Денатурация при 94 ° C для 30 секунды,
  • Отжиг при 65 ° С для 1 минута, затем выполнить 13 циклы (уменьшить температуру на 0,7 ° C за цикл),
  • Денатурация при 94 ° C для 30 секунды,
  • Отжиг при 56 ° С для 1 минута,
  • Расширение при 72 ° С для 1 минута, затем выполнить 25 циклы,
  • Окончательное удлинение при 72°C для 5 минуты (Использование машины для ПЦР от компании PE).

Первый, анализировать продукты селективного усиления электрофорезом на 0.8% агарозный гель (Содержит 0,5 мкг/мл EB).

5. Гелевый электрофорез

Разделить усиленные продукты, используя 6% Денатурирование полиакриламидного геля (0.5ММ толщина) и 1 × TBE Buffer (Био-рад секвенирование электрофореза).

  • Удалить гребень и предварительно заполнить гель при постоянной мощности 140 Вт для 30 Протокол до тех пор, пока температура не достигнет 47-49 ° C. Обязательно вымывайте мочевину из каждой колодцы.
  • Для избирательных продуктов усиления, Добавить равный объем буфера загрузки (98% формамид, 10мМ ЭДТА, 0.25% ксилол цианол, 0.25% бромфеноловый синий) и денатура при 94 ° C для 5 минуты (Использование машины для ПЦР от компании PE). После денатурации, быстро поместите на льду до загрузки.
  • Загрузить 8 мкл каждого образца в каждую полосу. Изначально, запустить гель при постоянной мощности 100 Вт примерно 2 Протокол, чтобы быстро сосредоточить образцы на дне скважины. Затем приспособитесь к постоянной мощности 60 Вт, Сохранение температуры около 43 ° C, Пока бромфенол синий не достигнет 2/3 расстояния от верхней части геля до стеклянной тарелки. Завершить электрофорез.

6. Серебряное окрашивание

  • Фиксационное решение: Добавить 100 мл ледяной уксусной кислоты в 900 мл деионизированной воды или вдвойниллированной воды.
  • Окрашивание раствора: Растворить 1G agno3 в 1 л деионизированной воды, затем добавьте 1.5 мл 37% Формальдегид.
  • Развивающее решение: Растворить 30G NA2CO3, 1.5 мл 37% Формальдегид, и 2 мг тиосульфата натрия в 1 л деионизированной воды.
  1. После электрофореза, Поместите стеклянную тарелку с гелем в пластиковый поднос для серебряного окрашивания.
  2. Фиксация: Добавьте решение для фиксации и осторожно встряхните на шейкер 30 минуты. Зарезервировать решение для фиксации после фиксации.
  3. Полоскание: Вымыть гель три раза деионизированной водой для 2 минуты каждый раз.
  4. Окрашивание: Поместите гель в окрашивающий поднос и залейте раствор из окрашивания (хранится при 4 ° C.). Осторожно встряхнуть на шейкер 30 минуты. После полоскания геля деионизированной водой для 10 секунды, Передайте его в развивающемся подносе.
  5. Разработка: Добавить разработанное решение (хранится при 4 ° C.) и осторожно встряхнуть, пока группы не перестанут расти.
  6. Завершение: Добавить используемое решение для фиксации с шага 2 и агитировать в течение нескольких минут. Промойте дистиллированной водой в течение нескольких минут после достижения оптимальных результатов.
  7. После удаления капель воды из геля и стеклянной пластины, Поместите его на Lightbox и сфотографировано с помощью цифровой камеры Nikon.

Краткое содержание

Спасибо за предоставление полной экспериментальной процедуры AFLP! Если у вас есть какие -либо вопросы или нужна дополнительная помощь, Пожалуйста, не стесняйтесь спрашивать нас. Мы рады предоставить поддержку и ответы.

Об авторе

Корзина для покупок
Прокрутить вверх