Развитие технологии ПЦР
- Полимеразной цепной реакции (ПЦР) это метод молекулярной биологии, используемый для амплификации определенных фрагментов ДНК..
- Ее можно рассматривать как особый тип репликации ДНК, происходящий вне живых организмов..
- ДНК-полимераза I была впервые обнаружена в 1955.
- Кленовский фрагмент E. палочка, обнаруженный в начале 1970-х годов доктором. ЧАС. Кленов, имеет экспериментальную ценность и практичность.
- Однако, этот фермент не термостойкий и денатурирует при высоких температурах, что делает его непригодным для использования в ПЦР, требующей высокотемпературной денатурации..
- Фермент, широко используемый сегодня, упоминается как Taq-полимераза, был выделен из бактерии Thermus aquaticus. 1976.
- Его характеристика термостойкости делает его идеальным ферментом., но его широкое распространение пришло после 1980-х годов..
- Оригинальная концепция ПЦР, аналогично репликации восстановления генов, было предложено доктором. Кьелл Клеппе 1971.
- Он опубликовал первый эксперимент чистой и временной репликации генов. (аналогично первым двум циклам ПЦР).
- ПЦР, разработанный сегодня, был впервые разработан доктором. Кэри Б.. Весна в 1983, когда Муллис работал в компании PE, предоставление компании особого положения в области ПЦР.
- Муллис и Сайки официально опубликовали первую соответствующую статью в 1985.
- С того времени, применение ПЦР быстро расширилось, а качество соответствующих статей превзошло многие другие методы исследования..
- Впоследствии, Технология ПЦР широко используется в биологических исследованиях и клинических применениях., становится решающим методом в исследованиях молекулярной биологии.
- Муллису была присуждена Нобелевская премия по химии. 1993 за его вклад.
Принцип ПЦР
Основной принцип технологии ПЦР аналогичен естественному процессу репликации ДНК., и его специфичность зависит от олигонуклеотидных праймеров, которые комплементарны целевой последовательности на обоих концах.. ПЦР состоит из трех основных этапов реакции.: денатурация, отжиг, и расширение:
- Денатурация матричной ДНК: После нагревания матрицы ДНК примерно до 93°C в течение определенного периода времени, двухцепочечная ДНК матричной ДНК или двухцепочечная ДНК, образовавшаяся в результате ПЦР-амплификации, диссоциируется, делая его одноцепочечным, чтобы он мог связываться с праймерами и готовиться к следующему раунду реакции.
- Отжиг (реассоциация) матричной ДНК и праймеров: После того как матричная ДНК денатурируется в одиночные нити., температура снижается примерно до 55°C, и комплементарные последовательности праймеров и одноцепочечной матричной ДНК соединяются в пары и связываются.
- Расширение праймеров: Под действием Taq ДНК-полимеразы, использование dNTP в качестве субстратов реакции и целевой последовательности в качестве матрицы, по принципу комплементарного спаривания оснований и полуконсервативной репликации, синтезируется новая полуконсервативная репликационная цепь, комплементарная цепи матричной ДНК.. Эту цепочку можно амплифицировать до миллионов копий целевого гена за 2 к 3 часов, повторяя денатурацию, отжиг, и процессы расширения.
Реакционная система ПЦР и условия проведения реакции Стандартная реакционная система ПЦР
| Компонент | Объем/концентрация |
|---|---|
| 10x буфер усиления | 10мкл |
| 4 виды смеси дНТФ | 200мкл |
| Праймеры | 10-100мкл |
| ДНК шаблона | 0.1-2мкг |
| ДНК-полимераза Taq | 2.5мкл |
| Мг2+ | 1.5ммоль/л |
| Двойная или тройная дистиллированная вода | 100мкл |
Пять элементов реакции ПЦР:
- Праймеры (Праймеры для ПЦР представляют собой фрагменты ДНК., праймерами для репликации клеточной ДНК являются цепи РНК.)
- Фермент
- дНТФ
- Шаблон
- Буферный раствор (для которого требуется Mg2+)
Стандартный процесс ПЦР состоит из трех этапов.:
- Денатурация ДНК (90°С-96°С): Под воздействием тепла, водородные связи в двухцепочечной матрице ДНК разрываются, образуя одноцепочечную ДНК.
- Отжиг (25°С-65°С): Температура системы снижается, позволяя праймерам связываться с матрицей ДНК, образуя локальные двухцепочечные регионы.
- Расширение (70°С-75°С): Под действием Taq-полимеразы (оптимальная активность около 72°C), использование дНТФ в качестве субстратов, расширение происходит с 5′ конец 3′ конец букваря, синтез цепи ДНК, комплементарной матрице.
Примечания:
- Каждый цикл подвергается денатурации., отжиг, и расширение, удвоение количества ДНК.
- Некоторые протоколы ПЦР, из-за короткой области усиления, может завершить репликацию, даже если активность Taq-полимеразы не оптимальна.
- В этих случаях, можно использовать двухэтапный метод, где отжиг и растяжение происходят одновременно при температуре от 60°C до 65°C., уменьшение количества температурных циклов и, таким образом, повышение скорости реакции.
Характеристики реакции ПЦР
Сильная специфичность
Специфичность реакции ПЦР определяется:
- Специфическое и правильное связывание праймеров с ДНК-матрицей..
- Принципы спаривания оснований.
- Достоверность реакции синтеза ДНК-полимеразы Taq.
- Специфичность и консервативность целевого гена.
Примечания:
- Правильное связывание праймеров с матрицей имеет решающее значение..
- Связывание праймеров с матрицей и удлинение цепей праймеров следуют принципам спаривания оснований..
- Точность реакции синтеза полимеразы и термостойкость ДНК-полимеразы Taq позволяют проводить отжиг. (реассоциация) матрицы и праймеров происходить при более высоких температурах, значительно повышая специфичность связывания и поддерживая высокий уровень точности для амплифицированного целевого сегмента гена..
- Более того, путем выбора целевых областей гена с высокой специфичностью и консервативностью, уровень специфичности еще больше повышается.
Высокая чувствительность
- Количество ПЦР-продукта увеличивается в геометрической прогрессии., включение увеличения начальных сумм шаблона из пикограмм (пг=10^-12) в микрограммы (мкг=10^-6).
- Он может обнаружить целевую клетку из миллиона клеток..
- При обнаружении вирусов, Чувствительность ПЦР может достигать 3 РФС (рекомбинантные образующие единицы), в бактериологии, минимальная скорость обнаружения 3 бактерии.
Просто и быстро
- В реакциях ПЦР используется термостойкая ДНК-полимераза Taq..
- После приготовления реакционной смеси, денатурация, отжиг, и реакции удлинения проводятся на жидкости для амплификации ДНК и на водяной бане., обычно завершает реакцию амплификации в 2 к 4 часы.
- Продукты амплификации обычно анализируют электрофорезом., без необходимости использования изотопов, тем самым сводя к минимуму радиоактивное загрязнение и облегчая распространение.
Низкие требования к чистоте образцов
- Нет необходимости изолировать вирусы, бактерии или культуральные клетки.; сырую ДНК и РНК можно использовать в качестве матриц для амплификации..
- Клинические образцы, такие как кровь, телесные жидкости, мокрота, волосы, клетки, живая ткань может быть напрямую использована для обнаружения амплификации ДНК..
Устранение неполадок ПЦР
Ложные негативы
Отсутствие полос амплификации в реакциях ПЦР часто обусловлено ключевыми факторами.:
Получение матричной нуклеиновой кислоты
- Загрязнения, такие как белки в матрице, наличие ингибиторов Taq-полимеразы, неполное удаление белков (особенно гистоны) из хромосомной ДНК, чрезмерные потери при извлечении шаблона, или вдыхание фенола может способствовать возникновению проблемы.
- Неполная денатурация матричных нуклеиновых кислот также может играть роль..
- Когда качество фермента и праймера хорошее, и полосы усиления не появляются, вероятно, это связано с проблемами переваривания образца или сбоями в процессе экстракции матричной нуклеиновой кислоты..
- Необходимо приготовить эффективные и стабильные растворы для пищеварения., и процедура должна оставаться фиксированной.
Инактивация ферментов
Это может потребовать замены фермента новым или использования комбинации старых и новых ферментов для анализа того, приводит ли потеря или недостаточность активности фермента к ложноотрицательным результатам.. Иногда, если забыть добавить Taq-полимеразу или бромид этидия, это также может вызвать проблемы..
Проблемы с праймером
- Качество и концентрация праймеров, симметрия концентраций праймеров, и различия в качестве синтеза праймеров в партиях могут повлиять на результаты ПЦР..
- Решения включают выбор надежных подразделений по синтезу праймеров., подтверждение концентрации праймера с помощью электрофореза в агарозном геле, обеспечение одинаковой интенсивности полос для обоих праймеров, хранение праймеров в высоких концентрациях в небольших аликвотах для предотвращения деградации, и обеспечение рационального дизайна праймеров для предотвращения таких проблем, как образование димеров праймеров..
Концентрация Mg2+
Концентрация ионов Mg2+ существенно влияет на эффективность ПЦР-амплификации.. Чрезмерные или недостаточные концентрации могут повлиять на специфичность или выход, что приводит к неудачному усилению.
Изменение объема реакции
Объемы ПЦР обычно варьируются от 20 мкл до 100 мкл., в зависимости от цели. Изменяющиеся объемы следует тщательно регулировать, чтобы не допустить сбоев..
Физические факторы
Денатурация имеет решающее значение, и неадекватная температура денатурации или отжига может привести к ложноотрицательным результатам.. Использование стандартных термометров для проверки температуры термоциклера или водяной бани может помочь предотвратить сбои..
Варианты целевой последовательности
Мутации или делеции в целевой последовательности могут повлиять на связывание праймера с матрицей., что приводит к неудачному усилению.
Ложные срабатывания
Наблюдаемые полосы амплификации ПЦР соответствуют полосам целевой последовательности., иногда кажутся более однородными и яркими. Возможные причины:
Неподходящий дизайн праймера:
Выбор последовательностей амплификации, гомологичных с нецелевыми последовательностями, может привести к получению неспецифических продуктов амплификации во время ПЦР.. Короткие целевые последовательности или праймеры могут привести к ложноположительным результатам.. Необходимо изменить дизайн праймеров.
Перекрестное загрязнение целевых последовательностей или продуктов амплификации:
Причины загрязнения:
- Загрязнение всего генома или больших его сегментов может привести к ложноположительным результатам..
- Загрязнение небольших фрагментов нуклеиновых кислот в воздухе также может вызывать ложноположительные результаты..
Как справиться с этой ситуацией
1. Строгие лабораторные практики:
- Обращайтесь с образцами осторожно, чтобы предотвратить попадание целевых последовательностей в пипетки или их разбрызгивание за пределы центрифужных пробирок..
- Автоклавируйте все реагенты и оборудование., за исключением ферментов и материалов, непереносимых к высоким температурам.
- Используйте одноразовые центрифужные пробирки и наконечники для пипеток, чтобы свести к минимуму загрязнение..
2. УФ-воздействие:
- Перед добавлением образца подвергайте реакционные пробирки и реагенты воздействию ультрафиолетового света, чтобы разрушить существующие нуклеиновые кислоты..
- Рассмотрение конструкции праймера:
- Тщательно разрабатывайте праймеры, чтобы свести к минимуму возможность перекрестной реактивности с нецелевыми последовательностями..
- Вложенные методы ПЦР:
- Внедрить методы вложенной ПЦР для смягчения или устранения ложноположительных результатов, вызванных загрязнением небольших фрагментов нуклеиновых кислот в воздухе..
Внешний вид неспецифических полос усиления
- После ПЦР-амплификации, появляются полосы, не соответствующие по размеру ожидаемым, либо больше, либо меньше, или одновременно появляются специфические и неспецифические полосы.
- Причинами появления неспецифических полос являются:
- Неполная комплементарность между праймерами и целевыми последовательностями, или образование димера праймера.
- Чрезмерная концентрация ионов Mg2+, слишком низкая температура отжига, и чрезмерное количество циклов ПЦР.
- Качество и количество фермента, с ферментами из некоторых источников, склонными к неспецифическим полосам, в то время как другие нет.
- Чрезмерное количество фермента иногда может привести к неспецифической амплификации..
- Контрмеры включают в себя:
- Изменение дизайна праймеров при необходимости.
- Уменьшение количества ферментов или переход на ферменты из других источников..
- Снижение концентрации праймера, соответствующее увеличение концентрации шаблона, и сокращение количества циклов.
- Соответствующее повышение температуры отжига или использование метода двух температурных точек. (денатурация при 93°C, отжиг и удлинение при температуре около 65°C).
Появление размазанных или полосатых полос.
ПЦР-амплификация иногда приводит к размазыванию или полосам полос..
- Это часто вызвано чрезмерным количеством фермента или плохим качеством фермента., высокая концентрация дНТФ, чрезмерная концентрация Mg2+, низкая температура отжига, или чрезмерное количество циклов.
- Контрмеры включают в себя:
- Уменьшение количества ферментов или переход на ферменты из других источников..
- Снижение концентрации dNTP.
- Соответствующее снижение концентрации Mg2+.
- Увеличение количества шаблонов.
- Уменьшение номера цикла.
