Кот нет: BC3830

Размер: 50Т/48С

Хранилище： Реагенты транспортируются при комнатной температуре, хранится по мере необходимости после прибытия, и стабильно внутри 0.5 годы.

Состав продукта

Реагент ⅰ: 20 мл×1. Хранение при -20℃；

Реагент Ⅱ: 60 мл×1. Хранение при -20℃.

Реагент Ⅲ: 0.55 мл×1. Хранение при -20℃, избегайте света. 5MM PNA Standard: 1 мл×1. Хранение при -20℃, избегайте света.

Подготовка стандартного разбавителя: брать 9 мл реагента ⅰ и добавить 1 мл реагента ⅱ, хорошо перемешать, и подождать использования. (Это также может быть получено в соответствии с соотношением реагента ⅰ: Реагент ⅱ = 9:1).

Описание продукта:

Каспаза - это семейство протеаз, участвующих в процессе апоптоза, в том числе больше, чем 10 члены. Каспаза-3 является наиболее важной терминальной протеазой в процессе апоптоза, и это также самая изученная каспаза; Он активирует про-каспазу-2,6,7,9, В частности, гидролизует множество ключевых апоптотических белков, такие как парп, и обеспечивает конденсацию хроматина, Апоптотическое образование тела, и фрагментация ядерной ДНК.

Колориметрический анализ каспазы-3 основан на гидролизе пептидного субстрата Devd-PNA (Аспирант- Glu-val-asp-p-нитроанилид) по каспазе-3, приводя к выпуску P-нитроанилина (ПНА) часть. п- Нитроанилин обладает высокой поглощением при 405 нм. Активность каспазы может быть рассчитана путем обнаружения PNA. Этот комплект подходит для тканей и клеток млекопитающих.

Требуемые реагенты и оборудование, которые не входят в комплект поставки:

Спектрофотометр/считыватель микропланшетов, 100icl cuvette/ 96-луночная пластина, центрифуга, Водяная баня/инкубатор, регулируемая пипетка, ступка/гомогенизатор, лед, и дистиллированная вода.

Процедура:

А. Базовые приготовления:

1. Клетки: Соберите клетки в центрифужную трубку, центрифуга и отбросить супернатант; Добавить 100 мкл реагента ⅱ к количеству клеток (о 106 клетки), встряхнуть и ресуспендировать осадок, затем стоять на льду в течение 15 минут, центрифуга 15000 г на 4 ℃ для 10 15 мин, возьми супернатант и поместите его на льду для (это может быть увеличено до 150-200 Реагент мкл ⅱ Если растрескивание недостаточно)
2. Салфетка: Согласно соотношению массы ткани (г): Реагент ⅱ Объем (мл) из 1:5-10 (рекомендуется взвесить около 0.1 г ткани и добавить 1 мл реагента ⅱ), Измельчить его в ледяной ванне или тщательно разрезать, поместите его на лед для 15 мин, центрифугировать это в 4 ℃ для 10-15 мин, возьмите супернатант и поместите его на лед для тестирования.

Б. Определение процедура:

1. Предварительно разогрейте спектрофотометр/считыватель микропланшетов для 30 минуты, отрегулировать длину волны, чтобы 405 нм, и отрегулировать дистиллированную воду до нуля.
2. Перед использованием, 5 Mmol/L PNA стандартный раствор разбавляется до 200, 100, 50, 25, 5, и 0 Стандартный раствор мкмоль/л со стандартным разбавителем раствора.
3. Определение образца (добавить следующие реагенты в последовательности в 96 колодезная пластина / Eptube)

Название реагента (мкл)	Пробирка (В)	Пустая трубка (АБ)	Стандартная трубка (КАК)
Реагент I	40	40
образец	50
Реагент II		50
Реагент III	10	10
стандартное решение			100
Хорошо перемешать, крышка 96 Хорошо тарелки плотно, и запечатать пленкой запечатывания. Инкубировать в 37 ℃ для 60-120 минуты. Когда изменение цвета очевидно, поглощение при 405 НМ может быть определен. Если изменение цвета не очевидно, Время инкубации может быть продлено соответствующим образом, даже на ночь. Трубные трубки должны сделать только 1-2 раз. Рассчитайте ΔAt = at-ab.			Немедленно определите поглощение при 405 нм

С. Активность расчет:

1. Установление стандартной кривой

Стандартное уравнение производится в соответствии с концентрацией стандартной трубки (Икс, мкмоль/л) и Δas (й, минус трубка с 0 концентрация). Определение ΔAT заменяется в стандартное уравнение, чтобы получить x (мкмоль/л).

2. Согласно увеличению процента активности ферментов

Увеличение процента активности каспазы-3 = ((экспериментальная группа лечения у)- АБ) / ((экспериментальная контрольная группа в)- АБ) × 100%

Метод простой и надежный и может использоваться для грубо определения активности фермента.

3. Рассчитано по активности ферментов

Одно единица - это количество фермента, которое будет расщеплять 1.0 NMOL колориметрического PNA-SUBSTRATE в час при 37 ℃ при насыщенных концентрациях субстрата. Мы можем рассчитать активность каспазы в образце.

Каспаза-3 активность (Ед/мг прот) = x × vuial (Против × cpr ) ÷ t × 103 = 2x ÷ cpr ÷ t

Виртуальная машина: Общий объем реакционной системы, 0.1 мл = 10-4 л; ПРОТИВ: Объем добавленного образца, 0.05 мл; Т: время реакции, 1 час; КПР: концентрация белка образца, мг/мл; 103: Коэффициент преобразования единицы, 1 мкмоль = 103 НМОЛ.

Примечание:

1. Со времени реагента я содержит восстановительный агент (DTT), рекомендуется разбавить образец 2 Время с дистиллированной водой, а затем используйте метод Брэдфорда для определения концентрации белка, чтобы уменьшить помехи DTT на определение концентрации белка. Не рекомендуется использовать метод BCA для определения белка
2. Наиболее распространенной причиной низкого значения активности каспазы является то, что клетки не подвергались апоптозу, Количество клеток слишком мало или время наблюдения - это при индукции апоптоза, Дело не в том, что чем больше доза, чем дольше время, Чем выше активность каспазы. Рекомендуется установить разные дозы и моменты времени, такие как 0, 2, 4, 8, 16, и 24 часы для обнаружения лучшей точки наблюдения.
3. Когда значение измеренной выборки выше верхнего предела стандартной кривой, образец можно разбавить реагентом ⅱ, а затем повторно измерить.
4. Плотно закройте 96-луночную пластину и запечатайте ее парафильмом. Инкубировать в 37 ºC, Значение OD405, когда цвет становится желтым 0.2, который можно измерить в это время. Незначительное изменение цвета может продлить реакцию или в течение ночи, Но когда активность фермента сильна, Слишком длительное время инкубации приведет к потере реакции линейной

Recent Product Citations：

• Деньги б , K , Джин т , и другие. NCK1-AS1 усиливает пролиферацию клеток глиомы, радиорезистентность, и хеморезистентность через путь miR-22-3p/igf1r cerna[Дж]. Биомедицина & Фармакотерапия, 2020, 129:110395.
• Ван Z. , Сюй Дж , MOU J J. , и другие. Новые ультраструктурные выводы по сердечным митохондриям скинганга в мягкой холодной среде[Дж]. Сравнительная биохимия и физиология — Часть молекулярная & Интегративная физиология, 2020, 249:110766.

Рекомендации:

• Коэн Г.М.. Каспазы: палачи апоптоза. Biochem J., 1997, 326:1-16.
• Janicker u, Sprrgart M L., Wati M R., ET Новая роль каспазы-3 в апоптозе[Дж]. Гибель и дифференциация клеток, 1999, 6:99-104.

Сопутствующие товары:

BC3810 CASPASE-1 Набор для анализа активности BC3820 CASPASE-2 Анализ активности KIT BC3840 CASPASE-4 Анализ активности KIT BC3850 CASPASE-5 Анализ активности комплект BC3860 Каспаза-6 Анализ активности. Комплект Active Acmessay Caspase-9 Active Activsay Kit Kit Kitcay Activise-9 Actibome.