Набор для обнаружения мутаций гена EGFR человека (ПЦР-флуоресцентный метод) 12Т для исследований

Описание продукта:

• Имя: Набор для обнаружения мутаций гена EGFR
• Цель: Качественное обнаружение 11 распространенные мутации в гене EGFR человека.
• Образцы: Образцы ДНК из залитых в парафин срезов пациентов с клинически диагностированным немелкоклеточным раком легкого.
• Проверка: Продукт был проверен на эффективность обнаружения мутаций целевого гена, но не сочетался с конкретными лекарствами в клинических испытаниях..

Использование и ограничения:

• Использовать: Результаты обнаружения могут помочь в отборе пациентов с немелкоклеточным раком легкого, подходящих для терапии, нацеленной на EGFR..
• Ограничения: Сами по себе результаты обнаружения не могут использоваться в качестве единственного основания для клинического диагноза..

Исходная информация:

• РЭФР: Рецептор эпидермального фактора роста, мембранный белок, имеющий решающее значение для пролиферации клеток, рост, ремонт, и выживаемость опухолевых клеток.
• Генная структура: Расположен в хромосоме 7 (7стр. 12~14), ген EGFR включает 28 экзоны. Экзоны 18-24 образуют домен тирозинкиназы, кодирующий ген.
• Фокус мутации: Большинство мутаций происходит в экзонах 18-21, особенно экзон 19 делеция и экзон 21 Мутация L858R.
• Клиническая значимость: Эти мутации предсказывают эффективность таргетных препаратов при лечении немелкоклеточного рака легких и определяют выбор препаратов для лечения опухолей..
• Требование FDA: Обнаружение мутации гена EGFR обязательно для пациентов, рассматривающих возможность лечения EGFR-TKI..

Стол 1: Распространенные мутации гена EGFR

Мутация	Экзон	Изменения аминокислотной последовательности	Изменения базовой последовательности	Космический идентификатор
Экс 18-Му-1	18	G719S	2155г>А	6252
Экс 18-Му-2	18	G719C	2155г>Т	6253
Экс 18-Му-3	18	G719A	2156г>С	6239
Экс 19-Му-1	19	Glu746-Ala750del	2235-2249принадлежащий	6223
Экс 20-Му-1	20	S768I	2303г>Т	6241
Экс 20-Му-2	20	Т790М	2369С>Т	6240
Экс 20-Му-3	20	V769-D770insASV	2307_2308insGCCAGCGTG	12376
Экс 20-Му-4	20	H773-V774insH	2319_2320insCAC	12377
Экс 20-Му-5	20	D770-N771insG	2310_2311insGGT	12378
Экс 21-Му-1	21	L858R	2573Т>г	6224
Экс 21-Му-2	21	L861Q	2582Т>А	6213

Принцип тестирования

Этот набор предназначен для обнаружения специфических мутаций в гене EGFR.. В его состав входят праймеры и зонды для обнаружения:

1. Мутации G719X (G719S, G719C, G719A) в экзоне 18,
2. Делеционные мутации экзона 19 (в том числе 2235-2249del 15),
3. Мутации S768I и T790M в экзоне 20,
4. Три типа инсерционных мутаций (2307_2308insGCCAGCGTG, 2319_2320insCAC, и 2310_2311insGGT),
5. Мутации L858R и L861Q в экзоне 21.

Во время обнаружения мутации, если образец содержит мутационные шаблоны ДНК:

• Праймеры и зонды, специфичные для обнаруженной мутации, будут связываться с ДНК-матрицей..
• ПЦР произойдет усиление, высвобождение сигналов флуоресценции.
• Мониторинг в реальном времени и выдача мощности сигнала флуоресценции будут проводиться с использованием флуоресцентного количественного усилителя ПЦР..

Если образец не содержит мутационных шаблонов ДНК:

• Праймеры и зонды, специфичные для мутации, не связываются с матричной ДНК., или их привязка будет заблокирована.
• Это приведет к отсутствию амплификации ПЦР или ингибированию амплификации ПЦР..
• Следовательно, никакие сигналы флуоресценции не будут выпущены.

Общий, набор позволяет качественно анализировать результаты обнаружения посредством мониторинга сигналов флуоресценции в реальном времени во время ПЦР-амплификации..

Стол 2 Основные ингредиенты набора

Номер трубки.	Название ярлыка	Основные ингредиенты	Характеристики упаковки (12 тесты/набор)	Характеристики упаковки (24 тесты/набор)
1	G719X Реакционная жидкость для ПЦР	ПЦР-буфер, дНТФ, Праймер и зонд G719X	1 трубка (290мкл)	1 трубка (580мкл)
2	S768I Реакционная жидкость для ПЦР	ПЦР-буфер, дНТФ, S768I праймер и зонд	1 трубка (290мкл)	1 трубка (580мкл)
3	T790M Реакционная жидкость для ПЦР	ПЦР-буфер, дНТФ, Праймер и зонд T790M	1 трубка (290мкл)	1 трубка (580мкл)
4	L858R Реакционная жидкость для ПЦР	ПЦР-буфер, дНТФ, Праймер и зонд L858R	1 трубка (290мкл)	1 трубка (580мкл)
5	L861Q Реакционная жидкость для ПЦР	ПЦР-буфер, дНТФ, Праймер и зонд L861Q	1 трубка (290мкл)	1 трубка (580мкл)
6	Реакционная жидкость для ПЦР Ins	ПЦР-буфер, дНТФ, Ins праймер и зонд	1 трубка (290мкл)	1 трубка (580мкл)
7	Реакционная жидкость для Дель ПЦР	ПЦР-буфер, дНТФ, Дель-праймер и зонд	1 трубка (290мкл)	1 трубка (580мкл)
8	Контроль качества ПЦР-реакционной жидкости	ПЦР-буфер, дНТФ, праймер и зонд для контроля качества	1 трубка (290мкл)	1 трубка (580мкл)
9	Ферментная смесь	Ферментная смесь, содержащая фермент Taq и фермент UNG.	1 трубка (24мкл)	1 трубка (48мкл)
10	Эталонный краситель	краситель ROX	1 трубка (45мкл)	1 трубка (90мкл)
11	Шаблон внутреннего стандарта	Внутренний стандартный шаблон ДНК	1 трубка (100мкл)	1 трубка (100мкл)
12	Слабо положительный контроль	Содержит шаблон ДНК мутации	1 трубка (200мкл)	1 трубка (200мкл)
13	Пустой контроль	Трис-HCl буфер (10мм)	1 трубка (200мкл)	1 трубка (200мкл)

Условия хранения и срок годности:

1. Срок годности набора составляет 9 месяцев при хранении при температуре -20℃±5℃ и в защищенном от света месте..
2. Сведите к минимуму замораживание и оттаивание до менее 6 раз за время использования.
3. Дата производства и срок годности указаны на этикетке..

Применимые инструменты:

1. Комплект совместим с Stratagene MX3000P., АБ 7500, и LightCycler 480 флуоресцентные количественные усилители для ПЦР в реальном времени.
2. Используйте канал FAM для сбора флуоресцентных сигналов амплификации гена EGFR., Канал VIC/JOE/HEX для внутренних стандартных сигналов амплификации генов, и настроить опорный сигнал (РОКС).

Требования к образцам:

1. Высококачественная ДНК имеет решающее значение. Набор подходит для обнаружения геномной ДНК человека, выделенной из залитых в парафин патологических тканей, наличие которых, по мнению врача, содержит опухолевые ткани.. Образцы внутри 3 предлагаются годы.
2. Набор для экстракции ДНК QIAGEN (ДНК QIAamp ФФПЭ Комплект тканей, Кот нет. 56404) Рекомендовано. Концентрацию и чистоту выделенной ДНК следует проверять с помощью УФ-спектрофотометра. (ОД260/ОД280: 1.8-2.0). Разбавьте ДНК до 10–15 нг/мкл и немедленно протестируйте или храните при температуре ниже -20 ℃ без повторного замораживания и оттаивания..

Методы испытаний:

1. Подготовка реагентов:

1. Дайте набору достичь комнатной температуры., полностью расплавить все компоненты, и центрифуга для 10 секунды.
2. Определить количество реакций (н) нужный. Подготовить 7 виды мутаций ПЦР-реакционные смеси и контроль качества ПЦР-реакционных смесей по указанному методу в табл. 3.
3. $н"="\text{Количество образцов}+\text{Пустой контроль (1Т)}+\text{Слабо положительный контроль (1Т)}$
4. Упакуйте подготовленную трубку 1-8 Реакционную жидкость для ПЦР в реакционные пробирки в соответствии с объемом упаковки 23 мкл на лунку..
5. Перенесите пробирки с ПЦР-реакцией в зону подготовки образцов.. Храните оставшийся реагент обратно в холодильнике при температуре -20℃ ±5℃ для замораживания и защиты от света..

Стол 3: Метод приготовления каждой реакционной системы ПЦР

Компонент	Формула однореакционной системы	Формула n реакционных систем
Реакционная жидкость для ПЦР	22.3мкл	22.3×n мкл
Ферментная смесь	0.2мкл	0.2×n мкл
Эталонный краситель (РОКС)	0.4мкл	0.4×n мкл
Шаблон внутреннего стандарта	0.1мкл	0.1×n мкл

2. Подготовка образцов:

(Зона подготовки образцов)

1. Экстракция образца ДНК:
   • Следуйте инструкциям, прилагаемым к приобретенному коммерческому набору для экстракции геномной ДНК..
2. Пример добавления:
   • а) Добавить геномную ДНК, слабоположительный контроль, и холостой контроль образцов, подлежащих тестированию, в реакционные пробирки, содержащие 1-8 Реакционная смесь для ПЦР. Каждый образец испытывается с 8 виды реакционной смеси для ПЦР, с дополнительным количеством 2 мкл на лунку. Рекомендуемая концентрация образца ДНК составляет 10–15 нг/мкл..
   • б) Если пробирки для ПЦР-реакций с добавленными шаблонами невозможно сразу разместить на приборе из-за временных ситуаций, временно храните их при температуре 2–8 ℃ и проводите обнаружение на приборе как можно скорее в течение 24 часы.

3. ПЦР-амплификация:

(Область амплификации нуклеиновой кислоты)

1. Запустите прибор и выполните самопроверку работоспособности прибора..
2. Возьмите пробирки для ПЦР-реакций, приготовленные в зоне подготовки образцов, и поместите их в соответствующие места в резервуаре для проб прибора.. Запишите последовательность размещения.
3. Установите соответствующие параметры для амплификации нуклеиновой кислоты в соответствии с таблицей. 4 и начать ПЦР-амплификацию. После завершения реакции, определить соответствующий порог флуоресценции (обычно ограничивается серединой фазы экспоненциального роста под логарифмической формой кривой усиления) получить значения Ct для разных каналов и рассчитать соответствующие значения △Ct в соответствии с кривой усиления.

Стол 4: Соответствующие параметры амплификации нуклеиновых кислот прибора

Условия реакции ПЦР	Фаза	Условия	Количество циклов
лечение УНГ	37℃	10 минуты (мин)	1
Предварительная дегенерация	95℃	5 минуты (мин)	1
ПЦР	95℃	15 секунды (с)	40
	60℃	60 секунды (с)
		(Сигналы флуоресценции, собранные в конце этой фазы)

Регистрация сигнала:

• ген EGFR: Сигналы флуоресценции собираются из канала FAM..
• Внутренний стандартный ген: Сигналы флуоресценции собираются с канала HEX/VIC/JOE..

Анализ результатов:

После завершения реакции, порог устанавливается в соответствии с кривой усиления для расчета △Ct (△Ct = Ct обнаружения мутаций — Обнаружение контроля качества Ct) и интерпретировать результаты.

Интерпретация результатов испытаний:

1. Определение эффективности набора:

1. Слабо положительный контроль:
   • Значение Ct канала FAM составляет ≤32 с очевидной фазой экспоненциального роста на кривой амплификации..
2. Пустой контроль:
   • Канал FAM не имеет кривой усиления, имеет прямую или слегка наклонную линию.. Нет очевидной фазы экспоненциального роста, Значение Ct ≥38.
3. Внутренний стандартный ген:
   • В пустом контроле, значение Ct канала HEX/VIC/JOE равно <38 с очевидной фазой экспоненциального роста.
   • В испытуемом образце и в пробирке со слабоположительной реакцией, случайное отсутствие сигнала в канале HEX/VIC/JOE, когда канал FAM имеет сигнал, может произойти из-за ингибирования амплификации внутреннего стандарта амплификацией целевого гена..

2. Определение эффективности образца:

1. Контроль качества ПЦР-реакционной жидкости:
   • Для канала FAM, Кт < 23, что указывает на передозировку геномной ДНК образца. Рекомендуемое повторное тестирование после разведения..
2. Контроль качества ПЦР-реакционной жидкости:
   • Для канала FAM, 23 ≤ Ct ≤ 30, что указывает на умеренную дозу образца геномной ДНК.
3. Контроль качества ПЦР-реакционной жидкости:
   • Для канала FAM, 30 < Кт < 34, что указывает на более низкую дозу образца геномной ДНК. Тип мутации можно проверить только в образцах с более высоким содержанием мутационной ДНК..
4. Контроль качества ПЦР-реакционной жидкости:
   • Для канала FAM, Ct ≥ 34, что указывает на слишком низкую добавленную дозу геномной ДНК образца. Требуется подготовка нового образца или добавление количества, используемого для обнаружения..

3. Определение результатов обнаружения:

После определения эффективности обнаружения, Рассчитайте значение △Ct эффективных образцов для обнаружения и определите результаты обнаружения в соответствии со следующими шагами и таблицей. 5 подтвердить наличие мутации в образце.

1. При обнаружении мутаций в образцах, Значение Ct > 36 указывает на то, что образец отрицательный или находится ниже нижнего предела обнаружения этого набора..
2. При обнаружении мутаций в образцах, если значение Ct ≤ 36, рассчитайте значение △Ct этой реакционной пробирки. Если значение △Ct меньше соответствующего значения △Ct Cut-Off, образец считается мутационно-положительным. В противном случае, он считается отрицательным по мутации или находится ниже нижнего предела обнаружения этого набора..
3. Применение вышеуказанных критериев определения, тип мутации положительного образца G719X может быть одним из G719S, G719C, и G719A. Тип мутации Ins-положительного образца может быть одним из V769-D770insASV., H773-V774insH, и D770-N771insG. Этот продукт не может быть разделен дальше.

Стол 5: Определение результатов

Реакционная жидкость	Тип мутации	Отрицательный	Позитивный
G719X Реакционная жидкость для ПЦР	G719X	Кт > 36 или нет значения Ct	Ct ≤ 36, ΔCt ≥ 7
S768I Реакционная жидкость для ПЦР	S768I	Кт > 36 или нет значения Ct	Ct ≤ 36, ΔCt ≥ 7
T790M Реакционная жидкость для ПЦР	Т790М	Кт > 36 или нет значения Ct	Ct ≤ 36, ΔCt ≥ 7
L858R Реакционная жидкость для ПЦР	L858R	Кт > 36 или нет значения Ct	Ct ≤ 36, ΔCt ≥ 7
L861Q Реакционная жидкость для ПЦР	L861Q	Кт > 36 или нет значения Ct	Ct ≤ 36, ΔCt ≥ 7
Реакционная жидкость для ПЦР Ins	Инс	Кт > 36 или нет значения Ct	Ct ≤ 36, ΔCt ≥ 6
Реакционная жидкость для Дель ПЦР	Принадлежащий	Кт > 36 или нет значения Ct	Ct ≤ 36, ΔCt ≥ 6

Ограничения методов испытаний:

1. Точность результатов обнаружения образцов зависит от качества их сбора., уход, и хранение. Ошибки в этих процессах могут привести к неточным результатам обнаружения.. Плохое качество ДНК во время обработки образца может привести к ложноотрицательным результатам.. Для канала FAM реакционной жидкости ПЦР контроля качества, образцы со значениями Ct между 23 и 30 указывают на относительно хорошее качество ДНК и умеренное добавление образцов, что приводит к наиболее точным результатам обнаружения.
2. Отрицательные результаты, полученные при обнаружении образцов, не могут исключить наличие мутаций с низкой распространенностью или мутаций в других локусах гена EGFR..
3. Результаты обнаружения этого набора предназначены для клинических целей при персонализированной медицине и не должны использоваться в качестве единственной основы для клинического диагноза..

Индексы производительности продукта:

1. Комплект полностью упакован без перелива содержимого.. Этикетка не повреждена, имеет четкое идентификационное содержание.. Состав набора правильный, без повторов и недостающих компонентов..
2. Конкретная ссылка обнаруживается с помощью 7 типы жидкости для реакции мутации, входящие в комплект, и все результаты обнаружения отрицательные.
3. Чувствительность соответствующих мутаций выявляют с помощью 7 типы жидкости для реакции мутации, входящие в комплект, и все результаты обнаружения положительные.
4. Самый низкий предел обнаружения может достигать 1%, позволяющий обнаруживать различные типы мутаций гена EGFR в 20нг геномной ДНК.
5. Набор используется для многократного обнаружения прецизионного эталона гена EGFR. 10 раз, с внутрианализовым коэффициентом вариации (резюме) ≤5%.

Меры предосторожности:

1. Этот набор предназначен только для диагностики in vitro..
2. Не смешивайте реагенты из этого набора с реагентами из других партий..
3. Слабоположительный контроль в этом наборе не заразен, но с ним следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом..
4. С остатками реагентов в наборе и отходами эксперимента следует обращаться в соответствии с правилами утилизации медицинских отходов..

Рекомендации:

1. Рекомендации NCCN по клинической практике в онкологии — Рекомендации по немелкоклеточному раку легких (Китайское издание), Версия 1.2009.
2. Хуан Цзе, Цюй Шуфан, и другие. Создание материалов для контроля мутаций гена EGFR человека. Китайский журнал фармацевтического анализа, 2011, 31(9):1758-1763.
3. Экспертный консенсус по обнаружению мутации гена рецептора эпидермального фактора роста у пациентов с немелкоклеточным раком легких в Китае. Китайский журнал патологии, 2011, 40(10).