중합효소 연쇄반응 (PCR) 분자 생물학 및 진단의 필수 도구입니다. 모든 PCR 반응의 중심에는 마스터 믹스가 있습니다. – DNA 증폭을위한 모든 주요 성분을 포함하는 미리마드 칵테일. 그러나이 중요한 PCR 구성 요소에 정확히 들어가는 것? 그리고 실험을위한 완벽한 마스터 믹스를 공식화하기 위해 어떤 고려 사항이 있어야합니다.? 이 포괄적 인 가이드는 간단한 용어로 모든 것을 깨뜨립니다..
PCR 마스터 믹스는 무엇입니까??
ㅏ PCR 마스터 믹스 사전 혼합 된 것입니다, DNA 주형 및 프라이머를 제외한 중합 효소 연쇄 반응을위한 모든 필수 성분을 포함하는 즉시 사용 가능한 용액. 일반적으로 포함됩니다:
- DNA 폴리머 라제 효소
- 데 옥시 뉴클레오티드 (dNTP)
- 반응 완충액
- 클로라이드 마그네슘
- 안정제 및 인핸서
마스터 믹스를 준비함으로써, 동일한 최적화 된 제제를 여러 반응 튜브 또는 판의 우물에 분취 할 수 있습니다.. 이것은 시간을 절약합니다, 오류를 줄입니다, 각 반응에 각 구성 요소를 개별적으로 추가하는 것과 비교하여 일관성을 향상시킵니다..
마스터 믹스는 PCR 게임 체인저입니다, 단순화 된 고 처리량 실험 설정 활성화. 일상적인 PCR을 수행하든 수천 개의 샘플을 분석하든, 마스터 믹스는 워크 플로를 간소화합니다.
PCR 마스터 믹스의 유형은 무엇입니까??
다양한 유형의 PCR 응용 프로그램에 최적화 된 많은 마스터 믹스 제품이 있습니다.:
- 표준 PCR –일상적인 DNA 증폭. 비 방지 폴리머 라제를 함유합니다.
- 고 충실도 PCR– 복제를 위해 교정 폴리머 라제를 사용합니다, 시퀀싱, 또는 높은 정확도가 필요한 응용 프로그램.
- 멀티 플렉스 PCR – 한 반응에서 다수의 대상을 공동 증폭하기위한 균형 프라이머를 포함합니다..
- 실시간 QPCR – 수량화를위한 프로브 또는 DNA 염료와 같은 형광 기자를 포함합니다..
- RT-PCR – RNA 템플릿을 증폭시키기위한 역전사 효소 효소를 함유한다.
- 핫 스타트 PCR – 억제제-차단 열 활성화 폴리머 라제를 사용하여 가짜 증폭 제품을 줄임으로써 특이성을 향상시킵니다..
- 빠른 사이클링 PCR – 처리량 증가를 위해 빠른 열 사이클링 프로토콜을 활성화합니다.
많은 마스터 믹스는 또한 특정 PCR 기기 또는 Taqman 프로브와 같은 탐지 화학에 사용하기 위해 사전 최적화되어 있습니다.. 따라서 특수 믹스를 특정 PCR 프로토콜과 일치시킵니다., 목표, 최상의 결과를위한 플랫폼.
실시간 실험을위한 QPCR 마스터 믹스
정량적 실시간 PCR 용 (qPCR) 실험, 특수 QPCR 마스터 믹스에는 형광 표지 된 프로브 또는 DNA 결합 염료가 포함되어있어 “실시간” 열 절연 중에.
일반적인 실시간 QPCR 마스터 믹스 유형에는 포함됩니다:
- SYBR 녹색 – 이중 가닥 DNA에 결합 할 때 형광이되는 염료를 삽입합니다.
- Taqman 프로브 – 증폭 동안 절단 된 형광 단-퀴어 프로브.
- 분자 신호 – 배경을 줄이기 위해 켄터가있는 형광 헤어핀 프로브.
- 혼성화 프로브 – 신호 생성에 대한 FRET 기반 인접 프로브.
특정 QPCR 검출 화학에 대해 제형 및 최적화 된 마스터 믹스 사용 반응 설정을 단순화하고 신뢰할 수있는, 민감한 결과.
PCR 마스터 믹스를 만드는 방법?
고품질 상업용 마스터 믹스 제품은 널리 사용 가능합니다, 사용자 정의 PCR 마스터 믹스를 만들 수도 있습니다.:
1. DNA 중합 효소 효소를 선택하십시오
이것은 DNA 증폭을 촉진하는 가장 중요한 구성 요소입니다.. 인기있는 옵션에는 TAQ가 포함됩니다, PFU, Q5, 포식, 암호, Tth. 처리성을 고려하십시오, 정확성, 확장 속도, 및 효소를 선택할 때 PCR 완충제와의 호환성.
2. 최적화 된 PCR 반응 완충제를 준비하십시오
버퍼는 이상적인 pH를 제공합니다, 소금 농도, 및 중합 효소 활성에 대한 보조 인자 호환성. 일반적인 구성 요소입니다:
- 트리스-HCl pH 8.5 – 연장 온도에서 중성 pH를 유지합니다
- Kcl 또는 (Th4)2SO4 – 전도도를위한 1가 양이온
- MgCl2 – 폴리머 라제에 대한 필수 분열 양이온 보조 인자
- PCR 인핸서 – 베타인, DMSO, BSA와 같은 안정제
3. 균형 잡힌 데 옥시 뉴클레오티드를 추가하십시오 (dNTP)
DATP의 등몰 블렌드를 사용하십시오, dCTP, dGTP, dTTP. 표준 농도는입니다 100-200 각각 μm dntp.
4. 필수 보조 인자를 포함하십시오
클로라이드 마그네슘 (MgCl2) 중합 효소 활성 및 특이성을위한 중요한 보조 인자입니다. AT 포함 1-5 MM 최종 농도.
5. 안정제를 추가하십시오
비 이온 세제, DTT, 트레할로스, 등. 저장 중 폴리머 라제 활동을 유지하는 데 도움이됩니다.
6. 구성 요소 농도를 조정합니다
편의를 위해, 두 배로 또는 4 배의 구성 요소로 농축 된 2x 또는 4x 마스터 믹스를 만듭니다..
7. 분취 량 전에 구성 요소를 철저히 혼합하십시오
균질 한 마스터 믹스를 보장하기 위해 Vortex 또는 반복적으로 피펫.
8. 스토리지를위한 일회용 분취 량을 만드십시오
동결-해동주기를 피하십시오. 최상의 결과를 얻으려면, 사용하기 전에 얼음에 얼어 붙은 냉동 및 해동 분취 량을 보관하십시오.
마스터 믹스를 처음 개발할 때, 폴리머 라제 제조업체가 시작점으로 제안한 완충 레시피 및 구성 요소 농도를 따르십시오..
반복 테스트를 통해 농도를 최적화하여 효율을 극대화하십시오, 특성, 감광도, 특정 PCR 프로토콜의 일관성, 기구, 그리고 응용 프로그램.
PCR 마스터 믹스를 사용하는 방법
반응에서 PCR 마스터 믹스를 사용하면 더 쉬울 수 없습니다.. 다음은 빠른 단계별 개요입니다:
- 해동 – 냉장 마스터가 얼음에 완전히 해동하도록하십시오.
- 와동 – 알 수퀴 팅 전에 균질성을 보장하기 위해 소용돌이 또는 위아래로 피펫 팅으로 잘 섞습니다..
- 분취 량 – 반응 크기에 따라 PCR 튜브 또는 플레이트 우물에 반응 당 적절한 부피의 마스터 믹스를 배제합니다..
- 프라이머 추가 – 피펫 전방 및 리버스 프라이머를 각 반응 튜브/웰에 넣습니다.
- 템플릿을 추가하십시오 – 각 반응에 DNA 샘플 또는 기타 템플릿을 추가하십시오..
- 위로 – 필요한 경우, 최종 원하는 반응 부피에 도달하기 위해 추가 PCR 등급 물을 추가하십시오..
- 혼합 – 각 반응의 모든 구성 요소를 결합하기 위해 부드럽게 와류 또는 피펫 믹스.
- 원심분리기 – 튜브/플레이트를 간단히 돌려 바닥에 내용물을 수집합니다.
- PCR – 열 사이클러에 반응을 놓고 PCR 실행을 시작하십시오.!
마스터 믹스를 사용할 때, 항상 DNA 템플릿을 마지막으로 추가하십시오, 프라이머 후, 반응 사이의 교차 오염을 피하기 위해.
PCR 마스터 믹스가 DNA 증폭력을 강화하는 방법?
PCR 마스터 믹스에는 즉시 사용 가능한 형식의 DNA 증폭을위한 필수 성분이 포함되어 있습니다.. 마스터 믹스를 사용하면 반응 설정이 단순화됩니다, 오류를 줄입니다, 일관성을 향상시킵니다.
표준 PCR에는 다양한 유형의 최적화 된 마스터 믹스를 사용할 수 있습니다., qPCR, 고 충실도 PCR, RT-PCR, 그리고 더. 자신만의 맞춤형 믹스를 만들 수도 있습니다, 그러나 상업용 제품은 광범위한 품질의 테스트와 편의성을 제공합니다.
PCR 마스터 믹스를 이해하면 모든 증폭 요구에 대한 성공적인 결과를 보장합니다.. 분자 생물학 툴킷의 마스터 믹스의 힘으로, DNA 실험이 쉬워집니다.
