Solarbio 피루베이트 카르복실라제 (PC) 활동 분석 키트

피루브산 카르복실라제 (PC) 활동 분석 키트

메모: 테스트 전에 예측을 위해 2~3개의 서로 다른 샘플을 채취합니다..

운영장비: 분광 광도계

고양이 번호: BC0730

크기:50T/48S

구성요소:

용액 추출: 액체 110 밀리리터×1. 4℃에서 보관.

시약 I: 액체 30 밀리리터×1. 4℃에서 보관.

시약 II: 액체 10 밀리리터×1. 4℃에서 보관.

시약 III: 가루×1. -20℃에서 보관. 함께 용해 5 증류수 1mL, 준비 후 -20 ℃에 보관하십시오.

시약 IV: 가루×1. -20℃에서 보관. 함께 용해 5 증류수 1mL, 준비 후 -20 ℃에 보관하십시오.

시약 V: 액체 5 밀리리터×1. 4℃에서 보관.

시약 VI: 액체 15 μL×1. 4℃에서 보관.

시약 VI 희석액 용액: 액체 10 밀리리터×1. 4℃에서 보관.

제품 설명:

피루 베이트 카르 복실 라제 (PC, EC 6.4.1.1) 미토콘드리아의 동물에 널리 존재합니다, 곰팡이와 효모, 그러나 식물과 대부분의 박테리아에서는 발견되지 않습니다. PC는 옥 살로 아세테이트의 주요 사후 부화입니다, 그리고 첫 번째 속도입니다- 글루코 네오 제네시스 과정에서 효소를 제한한다.

PC는 돌이킬 수 없을 정도로 피루 베이트를 촉매합니다, ATP, 옥 살로 아세테이트에 대한 CO2 및 물, ADP 및 PI, Malic dehydrogenase는 Acetoacetic acid 및 NADH로부터 말산 및 NAD+의 형성을 추가로 촉매한다.. PC의 효소 활성은 NADH AT의 산화 속도를 검출함으로써 반영 될 수있다. 340 nm.

필요하지만 제공되지 않는 시약 및 장비:

자외선 분광 광도계, 욕조, 책상 원심분리기, 욕조, 조절 가능한 피펫, 1 mL 석영 큐벳, 모르타르/균질화기, 얼음과 증류수.

절차:

나. 복잡한 추출:

• 수집 0.1 조직 또는 5 백만개의 세포, 추가하다 1 mL의 추출 용액, 박격포/균질화 제로 얼음을 갈아냅니다.
• 원심분리기 1000 ×g 10 at4 분,
• 상청액을 다른 튜브로 가져 가서 원심 분리하십시오 11000 ×g 15 at4 분.
• 상청액은 미토콘드리아에서 누출되는 PC를 감지하는 데 사용됩니다., 미토콘드리아 추출의 효과를 보여줍니다.
• 추가하다 1 퇴적물에 대한 추출 용액의 ml, 초음파로 분할 (힘 20%, 작업 시간 5s, 간격 10초, 반복하다 12 타임스), PC 및 단백질 함량의 효소 활성을 감지하는 데 사용.

II. 결정 절차:

• 자외선 분광 광도계를 예열하십시오 30 분, 파장을 조정하여 340 nm, 증류수로 0을 설정하다.
• 37 ℃에서 시약 i를 예열하십시오 15 분.
• 시약 VI의 부피 비에 따른 희석제 시약 VI: 시약 VI 희석제 용액 = 1.6:660(V:V), 시약이 사용될 때 시약을 준비하십시오.
• 작업 솔루션: 시약 II의 부피 비율로 솔루션을 만듭니다.: 시약 III: 시약 iv = 2:1:1, 시약이 사용될 때 시약을 준비하십시오.
• 다음 시약을 추가하십시오 1 mL 석영 큐벳:

시약 (μL)	빈 튜브 (비)	시험관 (티)
시약 I	450	450
작업 솔루션	320	320
시약 V	80	80
시약 VI	100	100
견본	–	50
증류수	50	–
위의 시약을 1 순서대로 ML 석영 큐벳, 작업 솔루션을 추가 한 후 타이밍, 잘 섞는다. 흡수를 감지하십시오 340 당시 NM 10 초, AT1 또는 AB1로 기록하십시오. 그런 다음 반응 용액으로 37 ° 수조에 접시를 넣으십시오. 2 분. 그것을 꺼내서 깨끗하게 닦으십시오, 당시에 흡광도를 즉시 측정하십시오 130 초, AT2 또는 AB2로 기록합니다. ΔAT = AT1- at2, ΔAB= AB1- AB2, ΔA = ΔAT-ΔAB. 빈 튜브는 한두 번만 테스트하면됩니다..

III. 계산:

단위 정의: 효소 활성의 한 단위는 효소의 양이 생성을 촉매하는 것으로 정의됩니다. 1 단백질 밀리그램마다 분당 NADH의 NMOL.

PC 활동(U/mg 프로트)=[ΔA × VRV ÷(ε×d)× 109]¶(VS×심폐소생술)÷ t = 1607 × ΔA ÷ CPR

 

이자형: NADH 어금니 멸종 계수, 6.22×103L/몰/cm; 디: 큐벳의 가벼운 경로, 1 센티미터;

로프: 총 반응량,1×10-3L; 대: 샘플량 (밀리리터), 0.05 밀리리터;

심폐소생술: 샘플 단백질 농도 (mg/mL); 티: 반응 시간 (분), 2 분;

109: 1 mol = 109 nmol.

메모:

1. 테스트 전에 예측을 위해 하나 또는 두 개의 다른 샘플을 섭취하십시오.. ΔA인지 결정하기 전에 Crude Enzyme 용액을 추출 용액으로 희석하는 것이 좋습니다.>0.8(측정하는 경우 96 잘 평평한 바닥 UV 플레이트, ΔA>0.5). 하는 동안, 응답 시간을 연장합니다 (5 분 또는 10 분) ΔA 인 경우 <0.01.

2. 빈 튜브는 각 시약 성분의 품질을 감지하기위한 감지 구멍입니다., 그리고 일반적으로 ΔAB의 변화가 초과되지 않는다는 0.05.
3. 샘플의 단백질 농도는 스스로 결정해야합니다.. 추출 용액은 비교적 높은 단백질 농도를 함유하고 있기 때문에 (~에 대한 1 mg/mL), 추출 용액의 단백질 농도는 샘플의 단백질 농도를 측정 할 때 공제되어야합니다..

4. 효소 활동을 계산하기 위해 샘플 단백질 농도를 사용하는 것이 좋습니다.. 샘플 신선한 무게를 사용하여 계산하는 경우, 세포질 추출물의 효소 활성을 측정해야합니다, 및 상청액 및 침전 효소 활성의 합은 총 효소 활성이다..
5. 이 키트의 시약은 완료하기에 충분합니다 50 튜브 반응.
6. 충수: 샘플 중량의 계산 공식: (샘플 테스트 번호는 50t/24s입니다)

1) 상청액:

단위 정의: 효소 활성의 한 단위는 효소의 양이 생성을 촉진하는 것입니다. 1 조직 1 그램마다 분당 NADH의 NMOL.

PC 활동 (U/g 중량) =[ΔA1 × VRV ÷(ε×d)× 109]¶(W²Ve×Vs)÷ t = 1607 × ΔA1 ÷ w

ΔA1: 상청액 흡광도;

이자형: NADH 어금니 멸종 계수, 6.22×103L/몰/cm; 디: 큐벳의 가벼운 경로, 1 센티미터;

로프: 총 반응량,1×10-3L; 대: 샘플량 (밀리리터), 0.05 밀리리터; 베: 추출 솔루션, 1 밀리리터;

심폐소생술: 샘플 단백질 농도 (mg/mL); 티: 반응 시간 (분), 2 분;

109: 1 mol = 109 nmol;

여: 샘플 중량, g.

2) 침전물:

단위 정의: 효소 활성의 한 단위는 효소의 양이 생성을 촉진하는 것입니다. 1 조직 1 그램마다 분당 NADH의 NMOL.

PC 활동 (U/g 중량) =[ΔA2 × VRV ÷(ε×d)× 109]¶(W²Ve×Vs)÷ t = 1607 × ΔA2 ÷ w

ΔA2: 퇴적물 흡수;

이자형: NADH 어금니 멸종 계수, 6.22×103L/몰/cm; 디: 큐벳의 가벼운 경로, 1 센티미터;

로프: 총 반응량,1×10-3L; 대: 샘플량 (밀리리터), 0.05 밀리리터;

베: 퇴적물 중지 부피, 1 밀리리터; 심폐소생술: 샘플 단백질 농도 (mg/mL); 티: 반응 시간 (분), 2 분;

109: 1 mol = 109 nmol;

여: 샘플 중량, g.

3) 총 활동

총 활동은 상청액 및 퇴적물에서의 PC 활동의 합입니다.. PC(U/g 중량)= 1607 × ΔA1 ÷ W+1607 × ΔA2 ÷ w.

실험예:

1. 1 추출 용액의 ml를 첨가합니다 0.1 균질화를위한 토끼 심장 조직의 G. 상청액이 희석됩니다 100 추출 용액이있는 시간, 그리고 강수량이 희석되었다 4 타임스. 그 다음에, 결정 단계에 따라 microquartzplate에 의해 측정됩니다, 상청액: ΔAT = A1T – a2t = 1.104-0.856 = 0.248, ΔAB = A1B – A2B = 1.021-0.988 = 0.033, D A1 = DAT – ΔAB = 0.248-0.033 = 0.215, 침전물: ΔAT = A1T – a2t = 1.07-0.716 = 0.354, ΔAB= A1B- A2B = 1.021-0.988 = 0.033, ΔA2 = ΔAT- ΔAB = 0.354-0.033 = 0.321

상청액: PC의 활동 (U/g 질량) = 1607 × Δ A1 ÷ W × 100 (희석비율) = 1607 × 0.215 ÷ 0.1 × 100 = 345505 U/g 질량;

강수량: PC의 효소 활성 (U/g 질량) = 1607 × ΔA2 ÷ W × 4 (희석비율) = 1607 × 0.321 ÷ 01.

× 4 = 20633.88 u/g 질량;

PC의 총 효소 활성 (U/g 질량) = 1607 × ΔA1 ÷ W × 100 (노동 희석) + 1607× ΔA2 ÷ w

= 1607 × 0.215 ÷ 0.1 × 100+1607 × 0.321 ÷ 0.1 × 4 = 366138.88 u/g 질량.

참고자료

[1] Esmail s. 케키,아메즈 a. 이스마엘. 일부 질병과 관련하여 노인의 산화 스트레스 상태 평가. 순수 및 응용 과학에 관한 국제 회의. 팔월 2018;

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