원스텝 RT-qPCR 키트 (조사)
제품 번호：ER101 사양：50T/100T 스토리지: -20°C에서 보관
제품소개：
이 생성물은 1 단계 역전사-실현 시간 형광 정량을위한 특수 시약입니다. PCR (RT-QPCR) 프로브 방법을 사용합니다. 이 제품과의 1 단계 RT-QPCR 반응을 수행하면 동일한 반응 튜브 내에서 지속적인 처리가 가능합니다., 감지 감도를 향상시키면서 절차를 단순화하고 샘플 간의 교차 오염을 피하는 것. 이 분석 키트는 새로운 역전사 효소를 사용합니다 (Hi-MMLV 역전사 효소), 새로 설계된 항체-개질 된 뜨거운 스타트 타트 타크 DNA 폴리머 라제, 및 1 단계 RT-QPCR 효소 혼합 형태로 RNase 억제제. 강화 된 RNA 친화력을 특징으로합니다, 열 안정성, 더 높은 증폭 효율, 그리고 특이성. 이를 통해 넓은 정량 범위 내에서 강력한 표준 곡선을 생성 할 수 있습니다., 상이한 발현 수준에서 다양한 표적 유전자의 정확한 정량화 촉진. 좋은 반복성과 높은 신뢰성을 제공합니다.
상품 내용：
| 구성요소 | ER101-01 + (50T) | ER101-02 + (100T) |
| 1 단계 RT-QPCR 효소 믹스 | 50μL | 100μL |
| 5× 1 단계 RT-QPCR 마스터 믹스 | 250μL | 500μL |
| RNase-free ddh2영형 | 1밀리리터 | 2× 1ml |
저장:
-20°C에서 보관, 최소 유효 기간이 있습니다 12 개월.
활동 정의:
템플릿/프라이머로 활성화 된 Mahi-Mahi 정자 DNA를 사용합니다, 활동은 다음과 같이 정의됩니다 1 단위 (유) 산이적 불용성 물질의 통합, 차지함으로써 10 내부 뉴클레오티드의 NMOL 30 74 ° C에서 분.
제품 사용:
이 분석 키트. RNA 발현의 정확하고 간단한 분석을 허용합니다, 특히 소량의 RNA를 검출하는 데 특히 적합합니다. 다양한 유형의 형광 정량적 PCR 기기와 호환됩니다..
메모：특정 회사의 경우’ 웰 간 형광 신호 불일치를 나타내는 실시간 PCR 증폭 기기, 이러한 오류를 수정하기 위해 ROX 참조 염료를 획득하려면 제조업체를 준비하거나 연락하십시오.. 실험 설계에 따라 자세한 세부 사항을 선택해야합니다, 기기 매뉴얼, 또는 다양한 형광 프로브의 특정 사용 요구 사항.
추가적으로, 이 분석 키트에는 GDNA가 포함되어 있지 않습니다 (게놈 DNA) 제거 구성 요소. 실험에 GDNA 간섭으로부터의 자유가 필요한 경우, GDNA 제거 단계를 수행하거나 후에 수행하십시오 RNA 추출 그런 다음이 분석 키트를 사용하여 실험을 진행하십시오.. 이 예방 조치는 실험 결과에 대한 잠재적 간섭을 방지합니다..
작동 단계:
- RNase-free 원심 분리기 튜브에서 다음 반응 혼합물을 준비하십시오:
| 시약 | 사용량 금액 | 최종 농도 |
| 1 단계 RT-QPCR 효소 믹스 | 1µL | - |
| 5× 1 단계 RT-QPCR 마스터 믹스 | 5µL | 1× |
| 전방 프라이머 (10µm) | 0.5-2.5μL | 0.2-1.0μm |
| 먼저 반대로 (10µm) | 0.5-2.5μL | 0.2-1.0μm |
| 조사 (10µm) | 0.25-1μL | - |
| 총 RNA | 1PG-1 µg | - |
| RNase-free ddh2영형 | 최대 25μl | - |
메모：실제 요구에 따라 각 구성 요소의 양을 조정할 수 있습니다..
- 다음 조건에서 한 단계 RT-QPCR 반응을 수행하십시오.:
| 방법/단계 | 에스타르 드 피Rocedure | 큐uick 피Rocedure | 사이클 |
| 50℃ | 15분 | 10분 | 1 |
| 95℃ | 3분 | 1분 | 1 |
| 95℃ | 15에스 | 5에스 | 45사이클 |
| 60℃ | 30에스 | 20에스 |
- 반응이 완료된 후, 실시간 PCR 기기의 증폭 곡선을 확인하고 결과를 분석하십시오..
지침:
- 1 단계 RT-QPCR 효소 믹스는 고농도의 글리세롤을 포함합니다.. 사용하기 전에, 믹스를 간단히 원심 분리하여 반응 튜브의 바닥에서 수집하십시오.. 부드럽게 위아래로 피펫을 피하여 철저히 섞습니다. 반응 설정을 위해, RNase-free 피펫 팁을 사용하십시오, EP 튜브, 등., 그리고 가능한 한 오염을 피하십시오.
- 일반적으로, 프라이머 최종 농도 0.2 µM은 최적의 증폭에 충분합니다. 반응 성능이 차선일 때, 범위 내에서 프라이머 농도를 조정하십시오 0.1 에게 1.0 µm. 프로브 농도는간에 조정될 수 있습니다 50 nm과 250 nm. QPCR은 매우 민감합니다, 반응 설정 중 템플릿 양의 정확도는 최종 정량화 결과에 큰 영향을 미칩니다.. 템플릿을 희석하는 것이 좋습니다 (예를 들어, 묽게 한 2-5 µL의 샘플) 실험적 재현성을 향상시키기 위해 반응 믹스에 추가하기 전에.
- 범위 내에서 증폭 제품 길이를 선택하십시오 80 bp to 200 bp. 복잡한 2 차 구조 및 고 GC 영역이있는 템플릿 용, 역전사 온도를 55 ° C로 올리면 증폭 효율 및 검출 감도가 향상 될 수 있습니다..
- 사용 된 실제 실시간 PCR 기기가 빠른 증폭주기를지지하는지 확인하십시오.. 초기 시도, 확인하기 위해 예비 실험을 수행하십시오. 사용 된 특정 실시간 PCR 기기에 필요한 최단 데이터 수집 시간 제한에 따라 연장 시간을 조정하십시오.. ABI와 같은 악기 7700 그리고 아비 7900, 적어도 사용하십시오 30 초. ABI를 위해 7000 그리고 아비 7300, 적어도 사용하십시오 31 초. ABI를 위해 7500, 적어도 사용하십시오 34 초. ABI 시리즈의 실시간 PCR 기기를 사용하는 경우, 용액 준비에 ROX 참조 염료를 포함하십시오.
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