인간 EGFR 유전자 돌연변이 검출 키트 (PCR-형광 방법) 12T 연구용

제품 설명:

• 이름: EGFR 유전자 돌연변이 검출 키트
• 목적: 질적 감지 11 인간 EGFR 유전자의 일반적인 돌연변이.
• 표본: 비소 세포 폐암으로 임상 적으로 진단 된 환자의 파라핀-매개 섹션의 DNA 표본.
• 확인: 제품은 표적 유전자 돌연변이의 검출 성능에 대해 검증되었지만 임상 시험에서 특정 약물과 결합되지 않았습니다..

사용 및 제한:

• 사용: 탐지 결과는 EGFR- 표적 치료에 적합한 비소 세포 폐암 환자를 스크리닝하는 데 도움이 될 수 있습니다..
• 제한사항: 탐지 결과만으로는 임상 진단의 유일한 기초로 사용할 수 없습니다..

배경 정보:

• EGFR: 표피 성장 인자 수용체, 세포 증식에 ​​중요한 막 단백질, 성장, 수리하다, 및 종양 세포 생존.
• 유전자 구조: 염색체에 위치합니다 7 (7P12 ~ 14), EGFR 유전자는 포함된다 28 엑손. 엑손 18-24 유전자를 암호화하는 티로신 키나제 도메인을 형성합니다.
• 돌연변이 초점: 대부분의 돌연변이는 엑손에서 발생합니다 18-21, 특히 엑손 19 삭제와 엑손 21 L858R 돌연변이.
• 임상 적 관련성: 이 돌연변이는 비소 세포 폐암 치료에서 표적화 된 약물의 효능을 예측하고 종양 치료 약물 선택을 안내합니다..
• FDA 요구 사항: EGFR 유전자 돌연변이 검출은 EGFR-TKI 치료를 고려한 환자에 대해 의무화된다..

테이블 1: EGFR 유전자의 일반적인 돌연변이

돌연변이	엑손	아미노산 서열의 변화	기본 시퀀스의 변화	우주 ID
Ex 18-MU-1	18	G719S	2155G>ㅏ	6252
Ex 18-MU-2	18	G719C	2155G>티	6253
Ex 18-MU-3	18	G719A	2156G>씨	6239
Ex 19-MU-1	19	GLU746-AA750DEL	2235-2249의	6223
Ex 20-MU-1	20	S768I	2303G>티	6241
Ex 20-MU-2	20	T790m	2369씨>티	6240
Ex 20-MU-3	20	v769-d770insasv	2307_2308insgccagcgtg	12376
Ex 20-MU-4	20	H773-V774INSH	2319_2320INSCAC	12377
Ex 20-MU-5	20	D770-N771INSG	2310_2311INSGGT	12378
Ex 21-MU-1	21	L858	2573티>G	6224
Ex 21-MU-2	21	L861Q	2582티>ㅏ	6213

테스트 원칙

이 키트는 EGFR 유전자의 특정 돌연변이를 감지하도록 설계되었습니다.. 여기에는 프라이머 및 검출을위한 프로브가 포함됩니다:

1. G719X 돌연변이 (G719S, G719C, G719A) 엑손에서 18,
2. 엑손의 결실 돌연변이 19 (2235-2249DEL 포함 15),
3. 엑손에서의 S768I 및 T790M 돌연변이 20,
4. 세 가지 유형의 삽입 돌연변이 (2307_2308insgccagcgtg, 2319_2320INSCAC, 및 2310_2311INSGGT),
5. 엑손에서의 L858R 및 L861Q 돌연변이 21.

돌연변이 검출 중, 샘플에 돌연변이 DNA 템플릿이 포함 된 경우:

• 검출 된 돌연변이에 특이적인 프라이머 및 프로브는 주형 DNA에 결합 할 것이다..
• PCR 증폭이 발생합니다, 형광 신호 방출.
• 형광 신호 강도의 실시간 모니터링 및 출력은 형광 정량 PCR 증폭기를 사용하여 수행됩니다..

샘플에 돌연변이 DNA 템플릿이 포함되지 않은 경우:

• 돌연변이에 특이적인 프라이머 및 프로브는 주형 DNA에 결합하지 않을 것이다., 또는 그들의 바인딩이 차단됩니다.
• 이것은 PCR 증폭 또는 억제 된 PCR 증폭을 초래하지 않을 것이다..
• 따라서, 형광 신호는 해제되지 않습니다.

전반적인, 이 키트는 PCR 증폭 동안 형광 신호의 실시간 모니터링을 통해 감지 결과의 질적 분석을 가능하게합니다..

테이블 2 키트의 주요 성분

튜브 번호.	레이블 이름	주요 성분	포장 사양 (12 테스트/키트)	포장 사양 (24 테스트/키트)
1	G719X PCR 반응 액체	PCR 완충액, dNTP, G719X 프라이머 및 프로브	1 튜브 (290µL)	1 튜브 (580µL)
2	S768I PCR 반응 액체	PCR 완충액, dNTP, S768i 프라이머 및 프로브	1 튜브 (290µL)	1 튜브 (580µL)
3	T790M PCR 반응 액체	PCR 완충액, dNTP, T790m 프라이머 및 프로브	1 튜브 (290µL)	1 튜브 (580µL)
4	L858R PCR 반응 액체	PCR 완충액, dNTP, L858R 프라이머 및 프로브	1 튜브 (290µL)	1 튜브 (580µL)
5	L861Q PCR 반응 액체	PCR 완충액, dNTP, L861Q 프라이머 및 프로브	1 튜브 (290µL)	1 튜브 (580µL)
6	INS PCR 반응 액체	PCR 완충액, dNTP, 프라이머 및 프로브	1 튜브 (290µL)	1 튜브 (580µL)
7	DEL PCR 반응 액체	PCR 완충액, dNTP, 첫 번째와 프로브	1 튜브 (290µL)	1 튜브 (580µL)
8	품질 관리 PCR 반응 액체	PCR 완충액, dNTP, 품질 관리 프라이머 및 프로브	1 튜브 (290µL)	1 튜브 (580µL)
9	효소 혼합물	TAQ 효소 및 UNG 효소를 함유하는 효소 혼합물	1 튜브 (24µL)	1 튜브 (48µL)
10	참조 염료	록 염료	1 튜브 (45µL)	1 튜브 (90µL)
11	내부 표준 템플릿	내부 표준 DNA 템플릿	1 튜브 (100µL)	1 튜브 (100µL)
12	약하게 긍정적 인 통제	돌연변이 DNA 주형을 포함하는	1 튜브 (200µL)	1 튜브 (200µL)
13	블랭크 컨트롤	트리스-HCl 완충기 (10mm)	1 튜브 (200µL)	1 튜브 (200µL)

저장 조건 및 저장 수명:

1. 키트의 저장 수명은입니다 9 -20 ° ± 5 ℃에 저장되고 빛으로부터 보호되는 달.
2. 동결과 해동을 최소화하십시오 6 사용 중에.
3. 생산 날짜 및 만료 날짜는 레이블에 표시됩니다..

적용 가능한 기기:

1. 이 키트는 Stratagene MX3000P와 호환됩니다, AB 7500, 그리고 lightcycler 480 실시간 형광 정량적 PCR 증폭기.
2. FAM 채널을 사용하여 EGFR 유전자 증폭의 형광 신호를 수집하십시오., 내부 표준 유전자 증폭 신호를위한 Vic/Joe/Hex 채널, 기준 신호를 설정하십시오 (록스).

표본 요구 사항:

1. 고품질 DNA가 중요합니다. 이 키트는 의사가 종양 조직을 함유 한 것으로 확인 된 파라핀-매개 병리학 적 조직에서 추출한 인간 게놈 DNA를 검출하는 데 적합하다.. 내부의 표본 3 몇 년이 제안됩니다.
2. Qiagen DNA 추출 키트 (Qiaamp DNA FFPE 티슈 키트, 고양이 번호. 56404) 권장됩니다. 추출 된 DNA 농도 및 순도는 UV 분광 광도계로 테스트해야합니다. (OD260/OD280: 1.8-2.0). DNA를 10-15ng/μl로 희석하고 즉시 테스트하거나 반복적 인 동결 및 해동없이 -20 ° 이하로 저장하십시오..

테스트 방법:

1. 시약 준비:

1. 키트가 실온에 도달하도록합니다, 모든 구성 요소를 완전히 녹입니다, 그리고 원심 분리기 10 초.
2. 반응 수를 결정하십시오 (N) 필요합니다. 준비하다 7 돌연변이 PCR 반응 혼합물 및 품질 관리 PCR 반응 혼합물의 유형 표에서 지정된 방법에 따라 3.
3. $N=\text{표본 수}+\text{블랭크 컨트롤 (1티)}+\text{약하게 긍정적 인 통제 (1티)}$
4. 준비된 튜브를 포장하십시오 1-8 PCR 반응 액체는 웰당 23μL의 포장량에 따른 반응 튜브 내로의 액체.
5. PCR 반응 튜브를 시편 준비 영역으로 옮깁니다. 냉동 및 빛으로부터의 보호를 위해 나머지 시약을 -20 ° ± 5 ℃로 다시 보관하십시오..

테이블 3: 각각의 PCR 반응 시스템의 제조 방법

요소	단일 반응 시스템의 공식	N 반응 시스템의 공식
PCR 반응 액체	22.3μL	22.3× n μl
효소 혼합물	0.2μL	0.2× n μl
참조 염료 (록스)	0.4μL	0.4× n μl
내부 표준 템플릿	0.1μL	0.1× n μl

2. 시편 준비:

(시편 준비 영역)

1. 시편 DNA의 추출:
   • 구매 한 상업용 게놈 DNA 추출 키트와 함께 제공된 지침을 따르십시오..
2. 샘플 추가:
   • ㅏ) 게놈 DNA를 추가하십시오, 약하게 긍정적 인 통제, 및 반응 튜브로 테스트 할 시편의 빈 제어를 1-8 PCR 반응 혼합물. 각 시편은 테스트됩니다 8 PCR 반응 혼합물의 유형, 웰당 2μL의 추가량이 있습니다. 시편 DNA의 권장 농도는 10-15ng/μl이다.
   • 비) 템플릿이 추가 된 PCR 반응 튜브를 임시 상황으로 인해 즉시 기기에 배치 할 수없는 경우, 일시적으로 2-8으로 저장하고 가능한 빨리 기기에서 감지를 수행하십시오. 24 시간.

3. PCR 증폭:

(핵산 증폭 영역)

1. 기기를 시작하고 기기 성능의 자체 검사를 수행하십시오.
2. 시편 준비 영역에서 제조 된 PCR 반응 튜브를 가져 와서 기기의 샘플 탱크에 해당 위치에 놓습니다.. 배치 시퀀스를 기록하십시오.
3. 표에 따른 핵산 증폭을위한 관련 매개 변수 설정 4 PCR 증폭을 시작하십시오. 반응이 완료된 후, 적절한 형광 임계 값을 정의하십시오 (일반적으로 증폭 곡선의 로그 형태 하에서 지수 성장 단계 중간에 구분) 다른 채널에 대한 CT 값을 얻고 증폭 곡선에 따라 관련 △ CT 값을 계산합니다..

테이블 4: 기기의 핵산 증폭의 관련 파라미터

PCR 반응 조건	단계	정황	사이클 수
Ung 치료	37℃	10 분 (분)	1
사전 여부	95℃	5 분 (분)	1
PCR	95℃	15 초 (에스)	40
	60℃	60 초 (에스)
		(이 단계의 끝에서 수집 된 형광 신호)

신호 획득:

• EGFR 유전자: 형광 신호는 FAM 채널에서 수집됩니다.
• 내부 표준 유전자: 형광 신호는 Hex/Vic/Joe 채널에서 수집됩니다.

결과 분석:

반응이 완료된 후, 임계 값은 증폭 곡선에 따라 설정되어 △ ct를 계산합니다. (CT = 돌연변이 검출 CT – 품질 관리 탐지 CT) 결과를 해석하십시오.

테스트 결과의 해석:

1. 키트 효과의 결정:

1. 약하게 긍정적 인 통제:
   • FAM 채널의 CT 값은 증폭 곡선에서 명백한 지수 성장 단계로 ≤32입니다..
2. 블랭크 컨트롤:
   • FAM 채널은 증폭 곡선이나 직선 또는 약간의 비스듬한 라인을 보여줍니다.. 명백한 지수 성장 단계는 없습니다, CT 값은 ≥38입니다.
3. 내부 표준 유전자:
   • 빈 제어에서, Hex/Vic/Joe 채널의 CT 값은 다음과 같습니다 <38 명백한 지수 성장 단계.
   • 시험 된 시편 및 약한 양성 반응 튜브에서, FAM 채널이 신호를 가질 때 HEX/VIC/JOE 채널에서 가끔 신호가 부재하는 것은 표적 유전자 증폭에 의한 내부 표준 증폭 억제로 인해 발생할 수 있습니다..

2. 시편 효과의 결정:

1. 품질 관리 PCR 반응 액체:
   • FAM 채널의 경우, 코네티컷 < 23, 시편 게놈 DNA 과다 복용을 나타냅니다. 희석 후 다시 테스트.
2. 품질 관리 PCR 반응 액체:
   • FAM 채널의 경우, 23 ≤ ct ≤ 30, 시편 게놈 DNA의 중간 용량을 나타냅니다.
3. 품질 관리 PCR 반응 액체:
   • FAM 채널의 경우, 30 < 코네티컷 < 34, 더 낮은 용량의 시편 게놈 DNA를 나타냅니다. 돌연변이 유형은 돌연변이 DNA의 함량이 높은 표본에서만 테스트 할 수 있습니다..
4. 품질 관리 PCR 반응 액체:
   • FAM 채널의 경우, CT ≥ 34, 표본 게놈 DNA의 복용량이 너무 낮음을 나타냅니다. 새로운 시편 준비 또는 탐지를위한 사용량 추가가 필요합니다..

3. 탐지 결과 결정:

탐지의 효과를 결정한 후, 효과적인 감지 시편의 t CT 값을 계산하고 다음 단계와 표에 따라 탐지 결과를 결정하십시오. 5 시편에서 돌연변이의 존재를 확인하기 위해.

1. 시편 돌연변이 검출에서, Ct 값 > 36 시편이 음수 이거나이 키트의 낮은 감지 한계 미만을 나타냅니다..
2. 시편 돌연변이 검출에서, CT 값이 ≤ 인 경우 36, 이 반응 튜브의 CT 값을 계산하십시오. CT 값이 해당 △ CT 컷오프 값보다 작은 경우, 시편은 돌연변이 양성으로 간주됩니다. 그렇지 않으면, 이 키트의 돌연변이 음성 또는 낮은 검출 한계 아래로 간주됩니다..
3. 위의 결정 기준을 적용합니다, G719X 양성 시편의 돌연변이 유형은 G719 중 하나 일 수 있습니다., G719C, 및 G719A. INS 양성 시편의 돌연변이 유형은 v769-d770insasv 중 하나 일 수 있습니다., H773-V774INSH, 및 D770-N771insg. 이 제품은 더 이상 나눌 수 없습니다.

테이블 5: 결과 결정

반응 액체	돌연변이 유형	부정적인	긍정적인
G719X PCR 반응 액체	G719X	코네티컷 > 36 또는 CT 값이 없습니다	코네티컷 ≤ 36, ΔCT ≥ 7
S768I PCR 반응 액체	S768I	코네티컷 > 36 또는 CT 값이 없습니다	코네티컷 ≤ 36, ΔCT ≥ 7
T790M PCR 반응 액체	T790m	코네티컷 > 36 또는 CT 값이 없습니다	코네티컷 ≤ 36, ΔCT ≥ 7
L858R PCR 반응 액체	L858	코네티컷 > 36 또는 CT 값이 없습니다	코네티컷 ≤ 36, ΔCT ≥ 7
L861Q PCR 반응 액체	L861Q	코네티컷 > 36 또는 CT 값이 없습니다	코네티컷 ≤ 36, ΔCT ≥ 7
INS PCR 반응 액체	안내	코네티컷 > 36 또는 CT 값이 없습니다	코네티컷 ≤ 36, ΔCT ≥ 6
DEL PCR 반응 액체	의	코네티컷 > 36 또는 CT 값이 없습니다	코네티컷 ≤ 36, ΔCT ≥ 6

테스트 방법의 한계:

1. 시편 감지 결과의 정확도는 시편 수집의 품질에 따라 다릅니다., 치료, 그리고 스토리지. 이러한 프로세스의 오류는 부정확 한 탐지 결과로 이어질 수 있습니다.. 시편 처리 중 DNA 품질이 잘못되면 잘못된 부정적인 결과가 발생할 수 있습니다.. 품질 관리 PCR 반응 액체의 FAM 채널 용., CT 값이있는 표본 23 그리고 30 비교적 우수한 DNA 품질과 적당한 샘플 첨가를 나타냅니다, 가장 정확한 탐지 결과를 초래합니다.
2. 시편 검출로부터 얻은 부정적인 결과 EGFR 유전자의 다른 유전자좌에서 낮은 풍부 또는 돌연변이가있는 돌연변이의 존재를 배제 할 수 없다..
3. 이 키트의 탐지 결과는 개인화 된 의약품을 안내하기위한 임상 참조를위한 것이며 임상 진단의 유일한 근거로 사용해서는 안됩니다..

제품 성능 지수:

1. 이 키트는 내용물이 넘치지 않고 완전히 포장되어 있습니다. 레이블은 명확한 식별 내용에 손상되지 않습니다. 키트의 구성은 반복 또는 누락 된 구성 요소없이 정확합니다..
2. 특정 참조는 다음을 사용하여 감지됩니다 7 키트에 포함 된 돌연변이 반응 액체의 유형, 그리고 모든 탐지 결과는 음수입니다.
3. 상응하는 돌연변이의 감도는 7 키트에 포함 된 돌연변이 반응 액체의 유형, 그리고 모든 탐지 결과는 긍정적입니다.
4. 가장 낮은 감지 한계에 도달 할 수 있습니다 1%, 20ng 게놈 DNA에서 다양한 유형의 EGFR 유전자 돌연변이의 검출 허용.
5. 이 키트는 EGFR 유전자의 정밀 기준을 반복적으로 감지하는 데 사용됩니다. 10 타임스, 분석 내 변동 계수 (CV) ≤5%.

지침:

1. 이 키트는 시험 관내 진단 전용입니다.
2. 이 키트의 시약을 다른 로트의 시약과 섞지 마십시오..
3. 이 키트의 약하게 긍정적 인 제어는 전염성이 없지만 잠재적으로 감염성 물질로 처리해야합니다..
4. 키트 및 실험 폐기물의 잔류 시약은 의료 폐기물 처리 지침에 따라 처리해야합니다..

참고자료:

1. 종양학의 NCCN 임상 실습 지침 – 비소 세포 폐암 지침 (중국판), v1.2009.
2. Huang Jie, Qu Shoufang, 외. 인간 EGFR 유전자 돌연변이 제어 물질의 확립. 중국 제약 분석 저널, 2011, 31(9):1758-1763.
3. 중국에서 비소 세포 폐암 환자의 표피 성장 인자 수용체의 유전자 돌연변이 검출에 대한 전문가 합의. 중국 병리학 저널, 2011, 40(10).