プロテイナーゼKは重要です 酵素 核酸製剤からタンパク質を消化および除去するために分子生物学ラボで使用される. このタンパク質分解酵素には、研究アプリケーションに非常に役立つ重要な特性があります. この投稿で, プロテイナーゼKとは何かを探ります, それがどのように機能するか, ラボでの多くの用途.
プロテイナーゼKとは?
プロテイナーゼKは、真菌のトリチラチウムアルバムから分離された広域スペクトルセリンプロテアーゼです. タンパク質をより小さなペプチドフラグメントとアミノ酸に急速に消化することができます.
名前 “プロテイナーゼk” ケラチンを消化する能力から来ています, 髪に見られる丈夫な構造タンパク質, 爪, 羽毛, 等. 菌類のトリチラチウムアルバムは、ケラチンが唯一の窒素源として提供されるときにプロテイナーゼKを分泌します.
プロテイナーゼkに関する事実は何ですか?
プロテイナーゼKに関するいくつかの重要な事実:
- 分類: ペプチダーゼファミリーS8に属します (subtilisinファミリー)
- 触媒タイプ: セリンプロテアーゼ
- 最適なpH:5 – 12.0
- 最適な温度:50℃ – 65℃
- 分子量:28,930 そして
プロテイナーゼKには3つのアミノ酸の触媒トライアドが含まれています – アスパラギン酸, ヒスチジン, とセリン. セリンはペプチド結合を切断する求核剤として作用します. カルシウムイオンは、完全な酵素活性にとって重要です.
プロテイナーゼKはどのように機能しますか?
セリンプロテアーゼとして, プロテイナーゼKは、脂肪族および芳香族アミノ酸のカルボキシル基に隣接するペプチド結合の加水分解を触媒します.
その作用のメカニズムは、キモトリプシンやトリプシンのような他のセリンプロテアーゼのメカニズムに似ています. これが重要な手順です:
- 酵素の触媒セリンは、ペプチド結合カルボニル炭素に対する求核攻撃を開始します.
- これは、水素結合によって安定化された四面体中間体を形成します.
- その後、窒素炭素結合が壊れます, 最初の生成物を放出し、アシル酵素中間体を形成します.
- 水分子は酵素を非アクティブにします, 2番目の製品をリリースします.
- これは、別のラウンドの触媒のために活性セリン部位を再生します.
プロテイナーゼKは、インテリアペプチド結合でエンドペプチダーゼとしてタンパク質を切断します. それは厳密な特異性を持っていませんが、大きな疎水性残基を好む. これにより、ほとんどのタンパク質をより小さな断片に急速に分解できます.
プロテイナーゼKとは何ですか?
プロテイナーゼKは分子生物学研究のための不可欠な試薬になっています. 最も一般的な用途のいくつかを次に示します:
消化汚染タンパク質
細胞および組織からDNAまたはRNAを分離する場合, プロテイナーゼKは、汚染タンパク質を消化するために使用されます. これにより、核酸製剤から不純物が除去されます. のような洗剤を追加します SDS 消化の強化のためにタンパク質を曝露するのに役立ちます.
不活性化ヌクレアーゼ
DNAとRNAを分解できる多くのヌクレアーゼはタンパク質自体です. プロテイナーゼKは、タンパク質分解切断によってこれらの有害なヌクレアーゼを急速に不活性化します. これにより、分離された核酸が分解から保護されます.
組織消化
プロテイナーゼKは、細胞を解離し、組織を可溶化するのに役立ちます, 抽出のために核酸を放出します. DNA/RNA精製プロトコルの組織溶解バッファーに含まれています.
タンパク質分析
プロテアーゼは、タンパク質構造に関する情報を提供する特定のペプチドフラグメントを生成します. プロテイナーゼK消化パターンは、タンパク質ドメインの研究に役立ちます, 変更サイト, 等.
感染性のプリオンを不活性化します
エンドペプチダーゼとして, プロテイナーゼKは、クロイツフェルド・ジャコブ病のような伝達可能な海綿状脳症の原因となるミスフォールドされたプリオンタンパク質を消化することができます. プリオンの汚染を不活性化するために使用されます.
DNAシーケンス
一部のDNAシーケンス方法は、シーケンス拡張後にプロテイナーゼKを使用してDNAポリメラーゼを除去します, 電気泳動のためにDNAを準備します.
in situハイブリダイゼーション
酵素は、RNAとDNAの完全性を維持しながら、ヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションのために固定細胞/組織を優しく透視化できます。.
プロテイナーゼKにはどのような条件が必要ですか?
以下は、プロテイナーゼKが適切に機能する必要がある条件です.
温度
プロテイナーゼKは、50°Cから65°Cの高い活性を示します, 最適な温度は約60°Cです. 37°Cでもタンパク質分解能力を保持します. 高温により、タンパク質構造がよりアクセスしやすくなる可能性があります.
pH
この酵素は、pHからの広いpH範囲で機能します 4 pHへ 12, pH間の最大アクティビティ 7.5 そして 12. アルカリの状態が最適です, しかし、ニュートラルなpHもうまく機能します.
洗剤
SDSのようなイオン洗剤の追加 (ドデシル硫酸ナトリウム) タンパク質基質を変性させることにより、プロテイナーゼK活性を高めることができます. のような非イオン性洗剤 トリトンX-100 また、機能します.
二重の陽イオン
プロテイナーゼKには、完全な酵素活性と安定性のためにカルシウムイオンが必要です. EDTAはカルシウムをキレートし、酵素を阻害できます. しかし, プロテイナーゼKは、カルシウムなしで何らかの機能を保持しています.
プロテイナーゼKはラボでどのように使用されていますか?
プロテイナーゼKにはラボで重要な機能があり、次の方法でラボで使用されています:
プロテイナーゼKバッファーレシピ
典型的なプロテイナーゼK消化バッファーが含まれています:
- 10 mM Tris-HCl pH 8.0
- 100 mm naCl
- 5% SDS
- 50 μg/mlプロテイナーゼK
TRISは、周りのアルカリ性pHを維持します 8.0. NaClはイオン強度を提供します. SDSは消化のためにタンパク質を変性させます. バッファーは必要に応じて変更できます.
消化プロトコル
- 使用する直前にプロテイナーゼKをバッファーに追加します.
- バッファーでサンプルをインキュベートします 30 minto 2 50°Cから65°CのHR.
- 95°Cで加熱することにより、プロテイナーゼKを不活性化します 10 minまたはPMSFの使用.
より長い消化または高温により、活動が増加する可能性があります. サンプルコンテキストは、最適な条件を決定します.
注意!
プロテイナーゼKは非常に強力なプロテアーゼです. 汚染サンプルや分解タンパク質を分析することを意図した分解タンパク質を避けるために注意する必要があります. 常に手袋を着用し、専用の用品を使用してください.
プロテイナーゼKはどのように不活性化されていますか?
プロテイナーゼKがその目的に役立つと, さらなる消化を止めるために不活性化する必要があります. ここにいくつかの方法があります:
- 加熱: 90°Cを超える温度は、酵素をすぐに不活性化します. しかし, 加熱は、残留活動を完全に排除しません.
- PMSF: この不可逆的なセリンプロテアーゼ阻害剤は、触媒セリンを共有結合して修正します, 永続的にブロッキングアクティビティ.
- aebsf: プロテイナーゼKを永久に不活性化する別のセリンプロテアーゼ阻害剤.
- TCA: トリクロロ酢酸は酵素を変性させて沈殿させます.
加熱は最も便利な方法です, しかし、セリンプロテアーゼ阻害剤は完全な不活性化を提供します.
プロテイナーゼKの代替品は何ですか?
プロテイナーゼKの代替品には含まれます:
- Pronase: Streptomyces Griseusから分離された非特異的プロテアーゼミックス.
- トリプシン: リジンとアルギニンの特異性を持つセリンプロテアーゼ.
- ペプシン: 哺乳類の胃液からのアスパラギン酸プロテアーゼ. 酸性条件下で最適に機能します.
- パパイン: パパイヤからのシステインプロテアーゼ. 細胞解離によく使用されます.
それぞれが分解タンパク質にプロテイナーゼKといくつかの重複があります, しかし、それらの特定の特性は異なります. プロテイナーゼKは、一般的なラボの目的で依然として最も広く使用されています.
結論
強力なセリンプロテアーゼプロテイナーゼKは、分子生物学の研究と診断に不可欠です. タンパク質を急速に消化しながら、過酷な状態で活性を維持する驚くべき能力は、汚染タンパク質を除去し、核酸を保護するための酵素になるための酵素になります.
プロテイナーゼKとは何かを理解します, それがどのように機能するか, そして、その最適な労働条件により、研究者は研究室での最大限の可能性を活用できます. この汎用性のあるプロテアーゼは、干渉タンパク質を排除し、有害なヌクレアーゼを不活性化して最高純度のDNAとRNAを回復することにより、無数の技術を可能にし続けています.
