ソーラービオ リブロース 1 5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ (ルビスコ) アッセイキット

注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを採取します.

操作装置: 分光光度計

カタログ番号: BC0440

サイズ:50T/48S

コンポーネント:

• リブロース 1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ (ルビスコ) 植物の光合成における重要な酵素です.
• 二酸化炭素の固定を制御し、カルビン回路と光呼吸サイクルへの炭素の流れを調節します。.
• ルビスコの活性は光合成速度に直接影響します.
• ルビスコはリブロース-1,5-二リン酸の​​結合を触媒します (RuBP) 3-ホスホグリセリン酸を生成するための二酸化炭素 (PGA).
• PGAはさらにグリセルアルデヒド-3-リン酸に変換されます, NADH の酸化を伴い NAD+ が形成される.
• NADH は次の光を吸収します。 340 nm, NAD+はそうではありませんが、.
• このキットでは, Rubisco 活性は、NADH 吸光度の減少を測定することによって決定されます。 340 nm.

必要だが提供されていない試薬と装置:

紫外分光光度計, 卓上遠心分離機, 調整可能なピペット, 水浴, 1 mL石英キュベット, モルタル/ホモジナイザー, 氷, 蒸留水.

手順:

サンプルの準備:

• • 細菌または細胞:
    • 細菌または細胞を遠沈管に集め、遠心分離して上清を廃棄します。.
    • 追加 1 抽出液 mL ～ 5 何百万もの細菌または細胞.
    • 超音波処理を使用する (氷の上で, 20% 力, 3 数秒後, 10 秒オフ, 繰り返された 30 回) 細菌または細胞を溶解する.
    • で遠心分離します。 10000 ×gの場合 10 4℃で3分間放置して不溶性物質を除去し、試験のために氷上で上清を収集します。.
  • 組織:
    • 追加 1 抽出液 mL ～ 0.1 組織グラム (できれば新鮮な植物サンプル) 氷上で均質化する.
    • で遠心分離します。 10000 ×gの場合 10 不溶性物質を除去するために 4°C で 5 分, 試験のために上清を氷上に集めます.

決定手順:

• • • • UV 分光光度計を予熱します。 30 分を測定し、波長を次のように調整します。 340 nm. 蒸留水で装置をゼロ調整します.
      • 以下の試薬を追加します:

試薬 (μL)	試験管 (T)	ブランクチューブ (B)
サンプル	100	–
蒸留水	–	100
試薬Ⅲ	35	35
試薬IV	35	35
実用的なソリューション	900	900

吸光度を検出します。 340 20秒と5分20秒の時点でnm, それぞれA1とA2として記録します. ΔA(T)=A2(T)-A1(T), ΔA(B)=A2(B)-A1(B), ΔA=ΔA(T)-ΔA(B). 反応中は25℃に保つ. ブランクチューブのテストは 1 〜 2 回だけで済みます.

計算:

実験例:

植物の葉を0.1g摂取する, 追加 1 均質化用抽出液 mL, 上清を取る, そして決定ステップに従って動作します.

マイクロ石英キュベットで測定し計算

ΔAT= AT1-AT2=1.279-1.206=0.073, ΔAB=AB1–AB2=0.834-0.823=0.011,

ΔA= ΔAT -ΔAB=0.073-0.011=0.062

ルビスコ活動 (U/g質量) = 344 × ΔA ÷ W =344×0.062÷0.1=213.28 U/g 質量.

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