Solarbio ピルビン酸カルボキシラーゼ (パソコン) 活性アッセイキット

ピルビン酸カルボキシラーゼ (パソコン) 活性アッセイキット

注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します.

操作装置: 分光光度計

カタログ番号: BC0730

サイズ:50T/48S

コンポーネント:

抽出液: 液体 110 mL×1. 4℃で保存.

試薬I: 液体 30 mL×1. 4℃で保存.

試薬II: 液体 10 mL×1. 4℃で保存.

試薬Ⅲ: パウダー×1. -20℃で保管. で溶かす 5 蒸留水 mL, 調理後は-20℃で保存.

試薬IV: パウダー×1. -20℃で保管. で溶かす 5 蒸留水 mL, 調理後は-20℃で保存.

試薬V: 液体 5 mL×1. 4℃で保存.

試薬VI: 液体 15 μL×1. 4℃で保存.

試薬 VI 希釈液: 液体 10 mL×1. 4℃で保存.

製品説明:

ピルビン酸カルボキシラーゼ (パソコン, EC 6.4.1.1) 動物のミトコンドリアに広く存在します, カビと酵母, しかし、植物やほとんどの細菌には存在しません. PC はオキサロ酢酸の主な後反応です, そして一流です- 糖新生過程における制限酵素.

PCはピルビン酸を不可逆的に触媒する, ATP, CO2と水からオキサロ酢酸へ, ADP と円周率, リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、アセト酢酸と NADH からのリンゴ酸と NAD+ の生成をさらに触媒します. NADHの酸化速度を検出することでPCの酵素活性を反映できます。 340 nm.

必要だが提供されていない試薬と装置:

紫外分光光度計, 水浴, 卓上遠心分離機, 水浴, 調整可能なピペット, 1 mL石英キュベット, モルタル/ホモジナイザー, 氷と蒸留水.

手順:

私. 複雑な抽出:

• 収集 0.1 組織グラムまたは 5 百万個の細胞, 追加 1 抽出液 mL, 氷上で乳鉢/ホモジナイザーを使用して粉砕.
• で遠心分離します。 1000 ×gの場合 10 4℃で4分,
• 上清を別のチューブに移し、50℃で遠心分離します。 11000 ×gの場合 15 4℃で4分.
• 上清はミトコンドリアから漏れ出したPCを検出するために使用されます。, ミトコンドリア抽出の効果を示す.
• 追加 1 沈殿物に対する抽出液 mL, 超音波で割る (力 20%, 作業時間5秒, 間隔10秒, 繰り返す 12 回), PCの酵素活性とタンパク質含有量の検出に使用されます。.

Ⅱ. 決定 手順:

• 予熱紫外分光光度計 30 分, 波長を調整して 340 nm, 蒸留水でゼロを設定する.
• 試薬 I を 37℃ で予熱します。 15 分.
• 希釈剤 試薬 VI の体積比に応じた試薬 VI: 試薬 VI 希釈液 = 1.6:660(V:V), 試薬を使用するときに準備します.
• 実用的なソリューション: 試薬Ⅱの体積比で溶液を作る: 試薬Ⅲ: 試薬 IV= 2:1:1, 試薬を使用するときに準備します.
• 次の試薬を追加します。 1 mL石英キュベット:

試薬 (μL)	ブランクチューブ (B)	試験管 (T)
試薬I	450	450
実用的なソリューション	320	320
試薬V	80	80
試薬VI	100	100
サンプル	–	50
蒸留水	50	–
上記の試薬を 1 mL 石英キュベットを順番に, 実用的な溶液を追加した後のタイミング, 十分に混ぜる. 吸光度を検出します。 340 当時のnm 10 秒, AT1 または AB1 として記録する. 反応液の入った皿を37℃のウォーターバスに入れ、 2 分. 取り出して綺麗に拭きます, 直ちに吸光度を測定します。 130 秒, AT2 または AB2 として記録する. ΔAT=AT1- AT2, ΔAB=AB1- AB2, ΔA= ΔAT-ΔAB. ブランクチューブのテストは 1 回か 2 回だけで済みます.

Ⅲ. 計算:

単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量として定義されます。 1 1分あたりのNADHのnmol、タンパク質1mgごと.

PC のアクティビティ(U/mgプロット)=[ΔA×Vrv÷(ε×d)×109]÷(VS×CPR)÷T =1607×ΔA÷Cpr

 

e: NADH モル吸光係数, 6.22×103L/mol/cm; d: キュベットの光路, 1 cm;

ロープ: 総反応量,1×10-3L; 対: サンプル量 (mL), 0.05 mL;

心肺蘇生法: サンプルタンパク質濃度 (mg/mL); T: 反応時間 (分), 2 分;

109: 1 mol=109nmol.

注記:

1. テスト前に予測のために 1 つまたは 2 つの異なるサンプルを取得します. ΔA が測定前に粗酵素液を抽出液で希釈することをお勧めします。>0.8(で測定する場合 96 ウェル平底 UV プレート, ΔA>0.5). その間, 応答時間を延長する (5 分または 10 分) ΔAの場合 <0.01.

2. 空管は試薬の各成分の品質を検出するための検出孔です, 通常、ΔAB の変化は以下を超えません。 0.05.
3. サンプルのタンパク質濃度は自分で決定する必要があります. 抽出液には比較的高濃度のタンパク質が含まれているため、 (について 1 mg/mL), サンプルのタンパク質濃度を測定する場合、抽出液のタンパク質濃度を差し引く必要があります。.

4. 酵素活性を計算するにはサンプルタンパク質濃度を使用することをお勧めします。. サンプルの新鮮重量を計算に使用する場合, 細胞質抽出物の酵素活性を測定する必要がある, 上清と沈殿酵素活性の合計が総酵素活性となります。.
5. このキット内の試薬は完了するのに十分です 50 チューブ反応.
6. 付録: サンプル重量の計算式: (サンプルテスト番号は50T/24Sです)

1) 上清:

単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量です。 1 組織 1 グラムごとの 1 分あたりの NADH の nmol.

PC のアクティビティ (U/g重量) =[ΔA1×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷T =1607×ΔA1÷W

ΔA1: 上清の吸光度;

e: NADH モル吸光係数, 6.22×103L/mol/cm; d: キュベットの光路, 1 cm;

ロープ: 総反応量,1×10-3L; 対: サンプル量 (mL), 0.05 mL; ヴェ: 抽出液, 1 mL;

心肺蘇生法: サンプルタンパク質濃度 (mg/mL); T: 反応時間 (分), 2 分;

109: 1 mol=109nmol;

W: サンプル重量, g.

2) 堆積物:

単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量です。 1 組織 1 グラムごとの 1 分あたりの NADH の nmol.

PC のアクティビティ (U/g重量) =[ΔA2×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷T =1607×ΔA2÷W

ΔA2: 沈殿物の吸光度;

e: NADH モル吸光係数, 6.22×103L/mol/cm; d: キュベットの光路, 1 cm;

ロープ: 総反応量,1×10-3L; 対: サンプル量 (mL), 0.05 mL;

ヴェ: 沈殿物の重い懸濁液量, 1 mL; 心肺蘇生法: サンプルタンパク質濃度 (mg/mL); T: 反応時間 (分), 2 分;

109: 1 mol=109nmol;

W: サンプル重量, g.

3) 合計 活動

総活性は上清と沈殿中の PC 活性の合計です。. パソコン(U/g重量)=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W.

実験例:

1. 1 抽出液 mL を加える 0.1 均質化用ウサギ心臓組織 g. 上清は希釈されます 100 抽出溶液で 3 回, そして沈殿物は薄められた 4 回. それから, 測定手順に従ってマイクロ石英板で測定, 上清: ΔAT = A1T – A2T= 1.104-0.856 =0.248, ΔAB = A1B – A2B = 1.021-0.988 = 0.033, ΔA1 = ΔAT – ΔAB = 0.248-0.033=0.215, 沈殿する: ΔAT = A1T – A2T= 1.07-0.716 =0.354, ΔAB=A1B- A2B = 1.021-0.988 = 0.033, ΔA2 = ΔAT- ΔAB =0.354-0.033= 0.321

上清: PCの活動 (U/g質量) = 1607 × D A1 ÷ W × 100 (希釈率) = 1607×0.215÷0.1× 100 = 345505 U/g質量;

降水量: PCの酵素活性 (U/g質量) = 1607×ΔA2 ÷ 幅×4 (希釈率) = 1607×0.321÷ 01.

× 4=20633.88 U/g 質量;

PCの総酵素活性 (U/g質量) = 1607×ΔA1÷W×100 (希釈) + 1607×ΔA2 ÷ W

=1607× 0.215 ÷0.1×100+1607×0.321÷0.1×4=366138.88U/g質量.

参考文献

[1] エスメールS. ケイキー,アメズA. イスマエル. いくつかの疾患に関連した高齢者の酸化ストレス状態の評価. 純粋応用科学に関する国際会議. 8月 2018;

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