Solarbio Glyceraldehyde-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(gapdh) 活性アッセイキット

グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(gapdh) 活性アッセイキット

注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します.

検出器: 分光光度計

カタログ番号: BC2210

サイズ: 25T/24 ; 50T/48S

コンポーネント:

抽出液: 60 mL×1. 4℃で保存.

試薬I: パウダー×1. -20℃で保存.

試薬II: 50 mL×1. 4℃で保存.

試薬Ⅲ: 30 μL×1. 4℃で保存. 液体は試薬ボトルのEPチューブに入れられます. 試薬IIIの投与量と体積比に応じて: の蒸留水 3:100, よく混ぜます, 今すぐ使用して準備してください.

製品説明:

gapdh (EC 1.2.1.12) グリセルアルデヒド3-リン酸の酸化を1,3-ジフォスホグリセリドに触媒します. それは解糖経路の重要な酵素です. 糖新生の経路に密接に関連しています, 血糖濃度の維持と糖尿病の発生. それはグルコースの障害で重要な役割を果たします, 脂質およびタンパク質代謝.

3-ホスホグリセル酸キナーゼは、三リン酸およびATPからの1,3-ジフォスホグリセリドの産生を触媒することができます. GAPDHは、グリセルアルデヒド-3-リン酸の形成を逆転させます, 1,3-ジフォスホグリセリドおよびNADHからの無機リンとNAD+. で測定されたNADHの減少 340 NMはGAPDHの活動を反映できます.

必要な材料

デスク遠心分離機, 紫外線分光光度計, 恒温水槽, モルタル/ホモジナイザー, 1 mL石英キュベット, 転送者, 氷と蒸留水.

手順:

私. サンプル 抽出:

1. 組織サンプル:

組織の質量によると (g): 抽出液の量 (mL) は 1: 5~10. 提案された 0.1 組織のg 1 抽出液 mL. 氷の上で完全に粉砕します, で遠心分離する 8000 gおよび4℃ 20 分. 上清がテストのために氷の上に置かれます.

2. 細菌とか細胞とか:

セルの数に応じて (104): 抽出液の量 (mL) は 500 ～ 1000: 1. 推薦する 5 百万 1 抽出溶液のml. 超音波を使用して、細菌または細胞を分割します (力 20% または200W, 作業時間3秒, 間隔10秒, 繰り返します 30 回). で遠心分離します。, 8000 gおよび4℃ 10 分. 上清がテストのために氷の上に置かれます.

3. 血清 (プラズマ): 直接測定.

Ⅱ. 決定 手順:

• 紫外線分光光度計を予熱します 30 分, 波長を340 nmに調整します, 蒸留水でゼロを設定する.
• 作業ソリューションの準備: すべての試薬IIを試薬の1つのボトルに注ぐ. 完全に溶解しました. 一定量の37℃を予熱します (哺乳類) または25℃ (他の種) のために 10 必要に応じて最小. 未使用の試薬は、サブ充電後-20°に保管するものとします. 繰り返しの凍結・融解を避ける.
• 次のリストを使用して試薬を追加します:

試薬名 (μL)	試験管 (T)	ブランクチューブ (B)
サンプル	30
蒸留水		30
試薬Ⅲ	20	20
実用的なソリューション	950	950
上記の試薬を 1 それぞれ mL 石英キュベット. 十分に混ぜ合わせてください. 吸収値A1を測定します 340 10代のNM. 37の水浴またはインキュベーターにすばやく入れます℃ (哺乳類) または25℃ (他の種) のために 5 分. 取り出して、すぐに乾燥させます. 5分間の吸光度値A2を測定します. Δat= a1tを計算します- A2t, ΔAB=A1B- A2B, Δa=Δat – ΔAB. 空白のチューブは1〜2回だけテストする必要があります.

Ⅲ. 計算:

マイクロクォーツキュベットによって計算されます

• タンパク質濃度によって計算されます:

単位の定義: 酵素活性の1つの単位は、の酵素の消費量として定義されます 1 1分あたりの反応システムにおけるNmolのNmol, タンパク質1mgごと.

GAPDHアクティビティ (U/mgプロット) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS×CPR)÷t = 1072×Δa÷cpr

• サンプル重量で計算されます

単位の定義: 酵素活性の1つの単位は、の酵素の消費量として定義されます 1 1分あたりの反応システムにおけるNmolのNmol, サンプル1gごとに.

GAPDHアクティビティ (U/生重量g) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(vs×w÷vst)÷t = 1072×Δa÷w

• 細菌または細胞量によって計算されます:

単位の定義: 酵素活性の1つの単位は、の酵素の消費量として定義されます 1 1分あたりの反応システムにおけるNmolのNmol, 毎 104 細菌とか細胞とか.

GAPDHアクティビティ (U/104セル) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(vs×500÷vst)÷t = 2.14×Δa

• 培地の量によって計算されます:

単位の定義: 酵素活性の1つの単位は、の酵素の消費量として定義されます 1 1分あたりの反応システムにおけるNmolのNmol, すべてのML液体.

GAPDHアクティビティ (U/mL) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷vs÷T = 1072×ΔA

 

e: NADHのモル絶滅係数: 6.22×103L/mol/cm; d: キュベットの光パス, 1 cm;

ロープ: 総反応量, 0.001 L;

VS: 反応システムのサンプル量, 0.03 mL; VST: 抽出溶液の量が追加されました, 1 mL; 心肺蘇生法: サンプルタンパク質濃度, mg/mL;

W, サンプル質量, g;

T: 反応時間, 5 分;

109: 変換係数, 1 mol = 109 nmol;

500: セルの数, 5 百万.

注記:

1. A1がより少ない場合 0.8 またはΔAはより大きい 0.7, 決定前にサンプルを希釈することをお勧めします.
2. ブランクチューブは、各試薬コンポーネントの品質をテストするための試験管です. 通常の条件下, 変更は01を超えません.

実験例:

1. 0.1gのウサギ腎臓を服用します, 追加 1 抽出液 mL, アイスバスで均質化します, 次に、8000gで遠心分離します, 4for 20 分, 上清を取り、氷の上に置きます, その後、決定手順に従ってマイクロクォーツキュベットで動作します, 測定して計算します: Δat= a1t-a2t = 0.815-0.158 = 0.657, ΔAB=A1B – A2B = 0.865-0.864 = 0.001, Δa=Δat – ΔAB= 656.

GAPDHアクティビティ (U/g質量) = 1072×Δa÷w = 7032.32 U/g質量.

2. 0.1gのクローバーを服用します, 追加 1 抽出液 mL, アイスバスで均質化します, 次に、8000gと4°で遠心分離します 20 分, 上清を取り、氷の上に置きます, 次に、決定手順に従って動作します, マイクロクォーツキュベットで測定して計算します, ΔAT = A1T – A2T = 1.026-1.017 = 0.009, ΔAB= a1b – A2B = 0.865-0.864 = 0.001, Δa=Δat – ΔAB= 008.

GAPDHアクティビティ (U/g質量) = 1072 ×Δa÷w = 85.76 U/g質量.

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