属性	詳細
注記	テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します
操作装置	分光光度計
カタログ番号	BC3230
サイズ	25T/24S; 50T/48S

コンポーネント:

抽出液: 80ML×1. 4℃で保存.

試薬 1: 40ML×1. 4℃で保存.

試薬 2: パウダー×1. -20℃で保管, 1mlのアセトンで溶解します. 溶解した試薬 2 分配後に-20℃で保存できます. 希薄 100 使用される時間.

試薬 3: パウダー×1. 4℃で保存, 使用する前に、3mlのアセトンで溶解します. 試薬 4: 5ML×1. 4℃で保存.

製品説明:

ミトコンドリア複合体IIは、コハク酸コイネズミQレダクターゼと同じです, 動物のミトコンドリアには広く存在します, 植物, 微生物と培養細胞. コハク酸を触媒してフマル酸を形成します, 流行を減らしてFADH2を形成します. FADH2は、酸化化されたCOQを減少させて、還元COQを形成します, これは、呼吸電子輸送チェーンの枝です.

複合体IIの触媒産物が2,6-ジクロロインドフェノールを減らすことができるcoq, 吸収性があります 605 nm, 酵素の活性は、の減少率を検出することによって計算できます 2, 6-ディクロリンドレフェノ.

必要だが提供されていない試薬と装置:

分光光度計, 水浴, 卓上遠心分離機, 移送ピペット, 1ML Glass Cuvette, モルタル/ホモジナイザー, アセトン, 氷と蒸留水.

1. 複合II 抽出:

• 0.1gの組織または 5 百万個の細胞, 1ml抽出溶液を加え、迫撃砲/ホモジナイザーで氷上で粉砕します;
• 600gおよび4℃での遠心分離機 10 分. 沈殿物を廃棄し、上清を別のチューブに移します, で遠心分離する, 11000gおよび4℃ 15 分;
• 上清, つまり, 細胞質抽出物, ミトコンドリアから漏れている複雑なIIを決定するために使用できます, このステップは、ミトコンドリア抽出の効果を示すことができます;
• 追加 400 堆積物に対するμL抽出溶液, 超音波処理で分割 (力 20%, 作業時間5秒, 間隔10秒, 繰り返す 15 回), 複雑なⅱ活性とタンパク質含有量を検出するために使用されます.

ステップの決定

1. 予熱用分光光度計 30 分, 波長を調整して 605 nm, 蒸留してカウンターをゼロに設定します
2. サンプルの決定

• 実用的なソリューションを作成します: 試薬を混合します 2 および試薬 3 によると 1:1 使用前に. 使用するときに準備します. 溶液が使用されるときに準備します.
• 37の予熱Reagent1 (哺乳類細胞) または25℃(他の種) のために 15
• 1mlのガラスキュベットに次の試薬を追加します:

試薬名 (uL)	試験管 (A1)
サンプル	50
試薬 1	750
実用的なソリューション	100
試薬 4	100
上記の試薬を1mlガラスキュベットに追加します, 十分に混ぜる, 10秒で吸光度を検出します (A1). キュベットと反応溶液を37個にまとめます(哺乳類) または25℃(他の種) 水浴用 2 分, その後、キュベットをすばやく取ります, 乾燥して吸収性を検出します 2 分 (A2), Δa= a1-a2

計算:

単位の定義: 酵素活性の1つの単位は、1nmolの消費を触媒する酵素の量として定義されます。 2, 6-毎分で組織タンパク質のmgあたりのジクロリンドレフェノ.

複雑なアクティビティ (U/mgプロット)=[ΔA×Vrv÷(ε×d)×109]÷(VS×CPR)÷t = 476.2×Δa÷cpr

e: 2, 6-ジクロリンドレフェノモル絶滅係数, 2.1×104L/mol/cm; d: キュベットの光パス, 1 cm;

ロープ: 総反応量,1mL; 対: サンプル量 (mL), 0.05 mL;

心肺蘇生法: サンプルタンパク質濃度 (mg/mL); T: 反応時間 (分), 2 分;

注記:

1. テスト前に予測のために2つまたは3つの異なるサンプルを採取して、実験結果の精度を確保する. 吸光度が高い場合、蒸留水で上清を希釈します 1.5. ΔAの場合、蒸留水でサンプルを希釈します>0.4, 式の希釈時間を掛けます. ΔAが遅い場合は、サンプル量を増やします.
2. サンプルタンパク質濃縮物を自分で検出します, 使用できます ソーラーバイオ (PC0020 BCAプロテイン アッセイキット). タンパク質は抽出物に含まれているためです, サンプルのタンパク質濃度を決定するときに、抽出物自体のタンパク質含有量を差し引く必要があります.
3. 酵素活性を計算するにはサンプルタンパク質濃度を使用することをお勧めします。. サンプルの新鮮重量を計算に使用する場合, 細胞質抽出物の酵素活性を測定する必要がある, 上清と沈殿酵素活性の合計が総酵素活性となります。.
4. それは十分です 50 チューブ反応.
5. アタッチメント: サンプル重量(50T/24S)

• 上清:

単位の定義: 酵素活性の1つの単位は、1nmolの消費を触媒する酵素の量として定義されます。 2, 6-ディクロリンドレフェノイン 1 組織重量のすべてのグラム.

複雑なアクティビティ(U/g)=[ΔA1×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷t = 476.2×Δa1÷wΔa1: 上清吸光度;

ロープ: 総反応量,1mL;

e: 2, 6-ジクロリンドレフェノモル絶滅係数, 2.1×104L/mol/cm; d: キュベットの光パス, 1 cm;

ヴェ: 溶液の体積を抽出します,1mL; 対: サンプル量 (mL), 0.05 mL; T: 反応時間 (分), 2 分;

W: サンプル重量, g.

• 堆積物:

単位の定義: 酵素活性の1つの単位は、1nmolの消費を触媒する酵素の量として定義されます。 2, 6-ディクロリンドレフェノイン 1 組織重量のすべてのグラム.

複雑なアクティビティ(U/g)= [ΔA2×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷t = 190.5×Δa2÷wΔa2: 堆積物吸光度;

ロープ: 総反応量,1mL;

e: 2, 6-ジクロリンドレフェノモル絶滅係数, 2.1×104L/mol/cm; d: キュベットの光パス, 1 cm;

ヴェ: 堆積物の再懸濁量,0.4 mL; 対: サンプル量 (mL), 0.05 mL;

T: 反応時間 (分), 2 分; W: サンプル重量, g.

• 総活動は、上清および堆積物における複雑な活動の合計です. 複雑なⅱ(U/g) = 476.2×Δa1÷w+190.5×Δa2÷w.

実験例:

1. 0.1gのウサギ肝臓サンプルを服用します, 追加 1 抽出液 mL, ホモジネートを粉砕して遠心にします, 決定手順に従って動作します. ΔA1= a1-a2 = 1.134-1.054 = 0.08 上清で, およびΔa2= a1-a2 = 1.371-1.347 = 0.024 降水で.

上清における複合IIの活動 (U/g質量) = 476.2×Δa1÷w = 476.2 ×0.08÷0.1 = 380.96 U/g質量

降水における複雑なIIの活動 (U/g質量) = 190.5×Δa2÷w = 190.5×0.024÷0.1 = 45.72

U/g質量

複合II (U/g質量) = 476.2×Δa1÷w + 190.5×Δa2÷w = 476.2×0.08÷0.1 + 190.5×0.024÷ 0.1 = 426.8U/g質量.

参考文献：

[1] MühlingJ, Tiefenbach m, ロペス・バルネオJ。, 他. ミトコンドリア複合体IIは、マウス心臓のα-ケト酸の正常酸素および低酸素調節に参加しています[J]. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2010, 49(6): 950-961.

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