ソーラーバイオ クレアチンキナーゼ (CK) 活性アッセイキット

クレアチンキナーゼ (CK) 活性アッセイキット

注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します.

操作装置: 分光光度計

カタログ番号: BC1140

サイズ:50T/48S

コンポーネント:

抽出液: 60 mL×1. 4℃で保存.

試薬I: 粉末×1, -20℃の暗所で保管. に溶解 10 使用前に蒸留水 mL, 未使用の試薬は再梱包後、-20℃で保管してください。, 繰り返しの凍結と解凍は禁止されています.

試薬II: 粉末×1, -20℃で保存. に溶解 0.5 使用前に蒸留水 mL, 未使用の試薬は再梱包後、-20℃で保管してください。, 繰り返しの凍結と解凍は禁止されています.

試薬Ⅲ: 粉末×2, -20℃で保存. に溶解 0.5 使用前に蒸留水 mL, 使い切れなかった試薬は再包装後、-20℃で保存してください。, 繰り返しの凍結と解凍は禁止されています.

試薬IV: 粉末×1, -20℃で保存. に溶解 0.65 使用前に蒸留水 mL, 未使用の試薬は再梱包後、-20℃で保管してください。, 繰り返しの凍結と解凍は禁止されています.

試薬V: 15 mL×1. 4℃で保存.

 

製品説明:

クレアチンキナーゼ (CK) (EC 2.7.3.2) クレアチンホスホキナーゼとしても知られています, 主に心の中に存在するもの, 筋, そして脳. クレアチンとATPの間のトランスリン反応を可逆的に触媒できます。. 細胞のエネルギー輸送に直接関係する重要なキナーゼです, 筋肉の収縮とATPの再生.

CKはクレアチンリン酸とADPを触媒してクレアチンとATPを生成します, ヘキソキナーゼはATPとグルコースを触媒してグルコース-6-リン酸を生成します, グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼはグルコース-6を触媒します- リン酸と NADP+ により NADPH を生成, その結果、 340 nm吸光度値, CK酵素活性を発現するために使用されます。.

必要だが提供されていない試薬と装置

天秤, 低温遠心分離機, 恒温水槽, 分光光度計, 1 mL 石英キュベットと蒸留水.

手順

私. 粗酵素液の抽出:

1. 1. 組織サンプル:

組織質量の割合 (g): 抽出液の量 (mL): 1:5~10 (約の重さを量ることをお勧めします 0.1 組織グラム, 追加 1 抽出液 mL) 氷浴の均一性のため. で遠心分離します。 10000 ×gの場合 15 4℃で5分, 上清を採取し、試験のために氷上に置きます.

2. 血清サンプル:

直接判定.

3. 細胞サンプル:

セルの数 (104): 抽出液の量(mL) 500~1000です:1 (1 mL の抽出液を追加することをお勧めします。 5 百万個の細胞), 抽出ソリューションが追加されます, 氷浴中で超音波により細胞を破壊する (力: 300W, 超音波: 3s, 間隔: 7s, 合計時間: 3 分). で遠心分離します。, 10000×gの場合 10 4℃で5分, 上清を採取し、試験のために氷上に置きます.

Ⅱ. テスト 手順:

1. 分光光度計を以上の時間予熱します。 30 分, 波長を調整して 340 nm, 蒸留水でゼロに調整します.
2. 実用的なソリューション: 試薬Iを混合する, 試薬II, 試薬Ⅲ, 試薬 IV と試薬 V の割合 70:4:7:10:90 (体積比) 使用前に. ソリューションをいつ使用するかを準備する. インキュベート 20 使用前に室温で数分 (このステップは省略できません).
3. 操作テーブル: 以下の試薬を加えます 1 mLキュベット

試薬名 (μL)	ブランクチューブ (AB)	試験管 (で)
粗酵素液	–	200
実用的なソリューション	450	450
蒸留水	550	350
上記の試薬を 1 それぞれ mL 石英キュベット, これらをよく混合し、吸光度値 A1 を測定します。 340 nmの 10 s, すぐに37℃の水槽に入れて、 3 分 (温度制御されたマイクロプレートリーダーは37℃に設定可能), で吸光度値 A2 を取り出します。 190 s を計算し、ΔAT = A2T を計算します。- A1T, ΔAB=A2B- A1B, ΔA =ΔAT-ΔAB. ブランクチューブの場合は 1 ～ 2 回だけ行う必要があります.

Ⅲ. の計算 CK:

• 組織タンパク質濃度から計算:

酵素活性の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量として定義されます。 1 37℃、pH7.0で1分間あたりのNADPH nmol/タンパク質1mg.

CK活動 (U/mgプロット) = ΔA÷(ε×d)×VRT×109 ÷ (VS×CPR) ÷ T= 268 ×ΔA÷Cpr

• 組織サンプルの品質によって計算されます:

酵素活性の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量として定義されます。 1 37℃、pH7.0でのサンプル1グラム当たりの1分間あたりのNADPHのnmol.

CK活動 (U/生重量g) = ΔA÷(ε×d)×VRT×109 ÷ (VS÷VST×W) ÷T= 268×ΔA÷W

• 血清量から計算:

酵素活性の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量として定義されます。 1 37℃、pH7.0における血清1ミリリットル当たりの1分間あたりのNADPHのnmol.

CK活動 (U/mL) = ΔA÷(ε×d)×VRV×109 ÷ VS ÷ T= 268×ΔA

• 細胞数による:

酵素活性の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量として定義されます。 1 37℃、pH7.0 で毎分 NADPH の nmol 10000 細胞.

CK活動 (U/104セル)=ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS ÷ VST×N)÷T=268 ×ΔA÷N

 

e: NADPHのモル吸光係数, 6.22×103L/mol/cm; d: キュベットの軽い直径, 1 cm;

VRT: 反応系の総容積, 0.001 mL;

VS: 反応系内のサンプル量, 0.2 mL; VST: 抽出液の量, 1 mL;

心肺蘇生法: サンプルタンパク質濃度, mg/mL; W: サンプル質量の質量, g;

N: セルの数, 104 単位; T: 反応時間, 3 分.

注記:

1. 血清のCKが安定しない. サンプルはできるだけ早く収集され、測定されます. 血清のCKは安定しています 24 4℃暗所保存後数時間.
2. サンプルのタンパク質含有量は別途決定する必要があります. BCAプロテイン 含有量測定キットを使用して測定できます.
3. OD 値が より大きい場合 0.6, サンプルは抽出液で適切に希釈できます, 希釈率に応じて計算式を変更可能.
4. ΔABは一般に超えません 01.

実験用インスタンス：

1. マウスの脳を0.1g採取する, 抽出液1mLを加える, 均質化して粉砕する. 上清を採取する, 次に抽出物で希釈します 4 測定された歩数に応じて時間を測定し、検出します. ΔAT=A2Tの計算- A1T=0.638-0.149=0.489, ΔAB=A2B-A1B=0， ΔA=ΔAT-ΔAB=0.489-0=0.489, サンプル重量に応じて酵素活性を計算します:

CK活性（U/g重量） =268×ΔA÷W×4（希釈倍率） =268×0.489÷0.1×4（希釈倍率）

=5242.08U/g 重量.

2. アヒルの血清を200μL採取し、直接検出します, ΔAT=A2T-A1T=0.445-0.423=0.022を計算します, ΔAB=A2B- A1B=0, ΔA=ΔAT-ΔAB=0.022-0=0.022, 血清量に応じて酵素活性を計算します:

CK活性（U/mL）=268×ΔA=268×0.022=5.896U/mL.

参考文献：

• デファン・リー, ニン・ルー, ハン・ジチュン, et al.エリオディクチオールはJAK2の活性化を通じて心筋虚血再灌流損傷を軽減する. 免疫学のフロンティア. 2018年1月;(IF3.845)
• シュー・イ, メン・エックス, ラブX, 他. ButhusmartensiiKarsch 抗腫瘍鎮痛ペプチドの変異体は、hNav1 に対する阻害の低下を示す. 4 と hNav1. 5 鎮痛活性を維持しながらチャネルを拡張します[J].生物化学ジャーナル, 2017, 292(44):18270-18280

関連製品：

BC2030/BC2035 イソクエン酸リアーゼ (ICL) 活性アッセイキット

BC3170/BC3175 酢酸キナーゼ (確認応答) 活性アッセイキット

BC3120/BC3125 植物脱水素酵素(PDHA) 活性アッセイキット

BC4220/BC4225 4-クマル酸補酵素Aリガーゼ (4CL) 活性アッセイキット

BC4220/BC4225 4-クマル酸補酵素Aリガーゼ (4CL) 活性アッセイキット