カタログ番号: BC3830

サイズ: 50T/48S

ストレージ： 試薬は室温で輸送されます, 到着後は必要に応じて保管, そしてその中で安定している 0.5 年.

製品構成

試薬Ⅰ: 20 mL×1. -20℃で保管；

試薬Ⅱ: 60 mL×1. -20℃で保管.

試薬Ⅲ: 0.55 mL×1. -20℃で保管, 光を避ける. 5mM pNA標準: 1 mL×1. -20℃で保管, 光を避ける.

標準希釈液の調製: 取る 9 試薬ⅠをmLに加え、 1 試薬Ⅱ mL, よく混ぜます, そして使用を待ちます. (試薬Ⅰの比率に合わせて調製することも可能です: 試薬Ⅱ＝ 9:1).

製品説明:

カスパーゼは、アポトーシスのプロセスに関与するプロテアーゼのファミリーです, 以上を含む 10 メンバー. カスパーゼ-3はアポトーシスの過程で最も重要な末端プロテアーゼです, そして最も研究されているカスパーゼでもあります; プロカスパーゼ-2、6、7、9を活性化します。, さまざまな重要なアポトーシスタンパク質を特異的に加水分解します, パープなど, クロマチンの凝縮を媒介します, アポトーシス体の形成, 核 DNA の断片化.

カスパーゼ-3 比色アッセイは、ペプチド基質 DEVD-pNA の加水分解に基づいています。 (アスプ- Glu-Val-Asp-p-ニトロアニリド) カスパーゼ-3による, その結果、p-ニトロアニリンが放出されます (pNA) 部分. p- ニトロアニリンは次の点で高い吸光度を持っています。 405 nm. pNAを検出することでカスパーゼ活性を算出できます。. このキットは哺乳類の組織および細胞に適しています.

必要だが提供されていない試薬と装置:

分光光度計/マイクロプレートリーダー, 100μLキュベット/96ウェルプレート, 遠心, ウォーターバス/インキュベーター, 調整可能なピペット, モルタル/ホモジナイザー, 氷, と蒸留水.

手順:

あ. サンプルの準備:

1. 細胞: 細胞を遠心管に集めます, 遠心分離して上清を捨てる; 細胞数に試薬Ⅱを100μL加える (について 106 細胞), 沈殿物を振って再懸濁する, その後、氷の上に15分間放置します, 4℃で15000g遠心分離 10 15 分, 上清を取り、氷上にしばらく置きます (まで増やすことができます 150-200 μL 割れが不十分な場合は試薬Ⅱ)
2. 組織: 組織質量の比率に応じて (g): 試薬Ⅱ量 (mL) の 1:5-10 (約の重さを量ることをお勧めします 0.1 ティッシュ1gを加えて 1 試薬Ⅱ mL), 氷浴中で粉砕するか、完全にカットしてください, 氷の上に置きます 15 分, 4℃で遠心分離します 10-15 分, 上清を採取し、試験のために氷上に置きます.

B. 決定 手順:

1. 分光光度計/マイクロプレートリーダーを予熱します。 30 分, 波長を調整して 405 nm, 蒸留水をゼロに調整します.
2. ご使用の前に, 5 mmol/L PNA標準液を以下に希釈します。 200, 100, 50, 25, 5, そして 0 μmol/L標準液と標準液希釈液.
3. サンプルの決定 (以下の試薬を順番に加えます。 96 ウェルプレート / EPチューブ)

試薬名（μL）	試験管 (で)	ブランクチューブ (AB)	標準チューブ (として)
試薬I	40	40
サンプル	50
試薬II		50
試薬Ⅲ	10	10
標準液			100
よく混ぜます, カバー 96 ウェルプレートをしっかりと固定する, そして封止フィルムで封止します. 37℃で培養します。 60-120 分. 色の変化が明らかな場合, での吸光度 405 nmを決定することができます. 色の変化が目立たない場合, インキュベーション時間は適切に延長できます, 一晩でも. 空のチューブだけを行う必要があります 1-2 回. ΔAT =AT-ABの計算.			405nmでの吸光度を即座に測定します。

C. 活動 計算:

1. 標準曲線の作成

標準管の濃度に応じて標準方程式を作成します (バツ, μmol/L) とΔAS (y, チューブをマイナスして 0 集中). ΔAT の決定を標準方程式に代入して x を取得します。 (μmol/L).

2. 酵素活性の割合の増加に応じて

カスパーゼ-3 活性の割合の増加 = ((実験的治療群 AT)- AB) / ((実験対照群AT)- AB) × 100%

この方法は簡単で信頼性が高く、酵素活性を大まかに測定するために使用できます。.

3. 酵素活性により算出

1 単位は切断する酵素の量です。 1.0 飽和基質濃度下、37℃、1時間あたりの比色pNA基質のnmol. サンプル中のカスパーゼ活性を計算できます.

カスパーゼ-3活性 (U/mgプロット) = x × VR ÷ (VS×CPR ) ÷T× 103 = 2x ÷ Cpr ÷ t

VR: 反応系の総容積, 0.1 mL = 10-4 L; VS: 追加したサンプルの量, 0.05 mL; T: 反応時間, 1 h; 心肺蘇生法: サンプルタンパク質の濃度, mg/mL; 103: 単位換算係数, 1 μモル = 103 nmol.

注記:

1. 試薬Iには還元剤が含まれているため、 (DTT), サンプルを希釈することをお勧めします 2 蒸留水で 2 回洗浄した後、ブラッドフォード法を使用してタンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度測定に対する DTT の干渉を軽減します。. タンパク質を測定するために BCA 法を使用することはお勧めできません
2. カスパーゼ活性値が低い最も一般的な理由は、細胞がアポトーシスを起こしていないことです。, 細胞の量が少なすぎる、または観察時間がアポトーシスを誘導する場合, 投与量が多ければ多いほどというわけではありません, 時間が長ければ長いほど, カスパーゼ活性が高いほど. 異なる投与量と時点を設定することをお勧めします。 0, 2, 4, 8, 16, そして 24 最良の観測点を検出するのに何時間もかかる.
3. 測定サンプルの値が検量線の上限値を超えている場合, サンプルを試薬Ⅱで希釈して再測定できます。.
4. 96 ウェルプレートをしっかりと覆い、パラフィルムで密封します。. で孵化させます 37 ℃, 色が黄色になったときのOD405値は約 0.2, 現時点で計測できるのは. わずかな色の変化により、反応が長引いたり、一晩かかったりする可能性があります。, しかし、酵素の働きが強いと, インキュベーション時間が長すぎると、反応の直線性が失われます。

最近の製品の引用：

• 王B , ワン・ケイ , ジン・T , 他. NCK1-AS1は神経膠腫細胞の増殖を促進します, 放射線耐性, miR-22-3p/IGF1R ceRNA経路を介した化学療法耐性[J]. 生物医学 & 薬物療法, 2020, 129:110395.
• ワン Z , 徐 JH , もぅJJ , 他. 穏やかな寒さの環境で群がるブラントハタネズミの心臓ミトコンドリアに関する新しい超微細構造の発見[J]. 比較生化学と生理学 – パート A 分子 & 統合生理学, 2020, 249:110766.

参考文献:

• コーエンGM. カスパーゼ: アポトーシスの死刑執行人. バイオケムJ, 1997, 326:1-16.
• ジャニッケ・アール・ユー, シュプレンガルト M L, ワティ M R, et アポトーシスにおけるカスパーゼ-3 の新たな役割[J]. 細胞死と分化, 1999, 6:99-104.

関連製品:

BC3810 カスパーゼ-1 活性アッセイ キット BC3820 カスパーゼ-2 活性アッセイ キット BC3840 カスパーゼ-4 活性アッセイ キット BC3850 カスパーゼ-5 活性アッセイ キット BC3860 カスパーゼ-6 活性アッセイ キット BC3880 カスパーゼ-8 活性アッセイ キット BC3890 カスパーゼ-9 活性アッセイ キット