β-ガラクトシダーゼ (β-GAL) アッセイキット
注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します.
操作装置: マイクロプレートリーダー/分光光度計
カタログ番号: BC2585
サイズ:100T/48S
コンポーネント:
抽出液: 液体 100 mL×1. 4℃で保存.
解決策 I: パウダー×1. -20℃で保管. 追加 2.55 ご使用前にボトル1本あたり蒸留水mLを加え、十分に溶かしてください。. 左側の試薬は-20℃で保管.
解決策Ⅱ: 液体 4 mL×1. 4℃で保存.
解決策Ⅲ: 液体 15 mL×1. 4℃で保存.
標準: 液体 1 mL×1. 4℃で保存. 5 μmol/mL p-ニトロフェノール溶液.
製品説明
β-ガラクトシダーゼ (β-GAL, EC 3.2.1.23) 動物に広く見られる酵素です, 植物, 微生物と培養細胞, β-ガラクトシル結合の加水分解を触媒し、グリコシル転移の機能もあります。. β-GALは植物の急速な成長のために貯蔵されたエネルギーを放出することができます, 多糖類の分解も触媒します, 糖タンパク質, 正常な多糖代謝におけるガラクトース末端のガラクトース残基, 細胞壁成分の代謝と老化中の細胞壁による遊離ガラクトース放出.
β-GAL は、p-ニトロ フェニル-β-ピラン ガラクトシドを触媒して p-ニトロ フェノールを生成することができます。. この製品は、次のような吸収特性を持っています。 400 nm. このキットでは, β-GAL 活性は、発色の増加を測定することで定量化されます。 400 nm.
必要だが提供されていない試薬と装置.
マイクロプレートリーダーまたは分光光度計, 遠心, 水浴, 移送ピペット, マイクロガラスキュベット/96ウェル平底プレート, 氷, 乳鉢/ホモジナイザーおよび蒸留水.
手順
私. 標準サンプルの調製:
- 細菌とか細胞とか
細菌や細胞を遠心管に集める, 遠心分離後、上清を廃棄します. 追加を提案する 1 抽出液 mL ～ 5 数百万の細菌または細胞. 超音波を使用して細菌と細胞を分割します。 (氷の上に置かれた, 超音波パワー 20%, 労働時間 3 秒, 間隔 10 秒, 繰り返します 30 回). 15000×gで遠心分離します。 20 4℃で3分間放置して不溶性物質を除去し、試験前に上清を氷上に取ります。.
- 組織
追加 1 抽出液 mL ～ 0.1 組織グラム, 氷浴上で完全に均質化. 15000×gで遠心分離します。 20 4℃で3分間不溶物を除去, 試験前に上清を氷上に置きます.
Ⅱ. 決定
- マイクロプレートリーダーまたは分光光度計を以上の時間予熱します。 30 分, 波長を調整して 400 nm, 蒸留水でゼロを設定する.
- 標準溶液を次のように希釈します。 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 nmol/mL（蒸留水使用）.
- 次のリストを使用して試薬を追加します:
| 試薬 | 試験管 (T) | コントラストチューブ (C) | 標準チューブ (S) |
| 解決策 I (μL) | 25 | – | – |
| 蒸留水 (μL) | – | 25 | – |
| 解決策Ⅱ (μL) | 35 | 35 | – |
| サンプル (μL) | 10 | 10 | – |
| 十分に混合し、反応液を 1 分間インキュベートします。 30 37℃ウォーターバスで3分. | |||
| 標準 (μL) | – | – | 70 |
| 解決策Ⅲ (μL) | 130 | 130 | 130 |
十分に混ぜ合わせてください. 各チューブの吸光度を検出します。 400 nm および AT と表記されます, 交流, ASとAB. 計算する
ΔAT=AT – 交流, ΔAS = AS – AB. 各試験管には 1 つの造影チューブが提供される必要があります.
Ⅲ. 計算する:
1. 標準曲線
確立された標準曲線: 標準チューブの濃度に応じて (y nmol/mL) および吸光度 ΔAS= AS – AB (バツ), 標準曲線を確立する. ΔA を標準曲線に追加します。, サンプルによって生成される生成物の量を計算します (nmol/mL).
2. 計算
- 組織タンパク質濃度
単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量として定義されます。 1 反応系中の1時間あたりのp-ニトロフェノールのnmol, タンパク質1mgごと.
β-GAL活性(U/mgプロット)=(y×Vrv)÷(VS×CPR)÷T=14×y÷Cpr
- 組織重量
単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量として定義されます。 1 反応系中の1時間あたりのp-ニトロフェノールのnmol, サンプル1gごとに.
β-GAL活性(U/g )= (y×Vrv)÷(W×Vs÷Ve)÷T=14×y÷W
- 細菌または培養細胞
単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量として定義されます。 1 反応系中の1時間あたりのp-ニトロフェノールのnmol, 毎 104 細菌とか細胞とか.
β-GAL活性(U/104セル)=(y×Vrv)÷(500×Vs÷Ve)÷T=0.028×y
心肺蘇生法: 上清サンプルのタンパク質濃度 (mg/mL); ロープ: 総反応量, 0.07 mL;
対: 上澄みのボリューム, 0.01 mL; ヴェ: 抽出液量,1 mL;
T: 反応時間 (分), 30 分 = 0.5 時間; W: サンプル重量, g;
500: 5 数百万の細胞または細菌.
関連製品：
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