- Componenti del kit di reagenti
| Specifiche | 50T | 100T |
| Gatto. NO. | SN0303 | SN0304 |
| Colonne di estrazione dell'RNA (impostato) | 50 (impostato) | 100 (impostato) |
| DNasi I | 1ml | 1ml |
| 10 × Tampone di reazione | 1 ml | 2 ×1ml |
| Tampone Trizol | 50 ml | 2 × 50 ml |
| Tampone di rimozione degli inibitori | 30 ml | 2 × 30 ml |
| Tampone di lavaggio 1 | 15 ml | 2 × 15 ml |
| Tampone di eluizione | 20 ml | 2 ×20 ml |
| Manuale di istruzioni | 1 | 1 |
- Magazzinaggio
Questo kit di reagenti deve essere conservato a temperatura ambiente (15-25℃) in un ambiente asciutto ed è stabile per 12 mesi. DNasi I contiene un conservante, consentendo il trasporto a temperatura ambiente, ma per la conservazione a lungo termine, dovrebbe essere mantenuto a -20 ℃.
- Istruzioni per l'uso del kit di reagenti
3.1 Questo kit è destinato a scopi di ricerca in biologia molecolare e non deve essere utilizzato per la diagnosi o il trattamento di malattie.
3.2 Alcuni componenti del kit contengono sostanze irritanti; è opportuno prendere le dovute precauzioni (come indossare indumenti protettivi e occhiali protettivi).
3.3 L'utilizzo di questo kit richiede apparecchiature aggiuntive come una centrifuga ad alta velocità, bagnomaria (bagno di metallo), miscelatore a vortice, etanolo anidro, azoto liquido, cloroformio, acqua deionizzata sterile, e tubi EP.
- Introduzione al kit di reagenti
Questo kit di purificazione dell'RNA utilizza il tradizionale TRIzol combinato con il metodo a membrana a colonna per la purificazione rapida delle piante, animale, tessuto, cella, RNA microbico, e RNA delle ife fungine. È adatto per la maggior parte delle specie. Questo kit di purificazione dell'RNA può essere applicato ai tessuti vegetali in eccesso 100 mg. L'RNA estratto con questo kit ha un contenuto di DNA estremamente basso. Se la sensibilità al DNA negli esperimenti è una preoccupazione, si consiglia di utilizzare la digestione con DNasi I sulla colonna.
L'RNA Fast Purification Kit può estrarre l'RNA totale dai campioni (compreso l'RNA nucleare e l'RNA citoplasmatico) entro 1 ora. L'RNA estratto può essere utilizzato direttamente per la RT-PCR, Northern blotting, e altre applicazioni.
- Principi e procedure sperimentali
- Processo di estrazione
Precauzioni prima di iniziare l'esperimento:
UN. Prima dell'uso, aggiungere la quantità specificata di etanolo assoluto LavareRespingente 1 secondo l'etichetta sulla bottiglia del reagente, e seleziona la casella sull'etichetta per indicare che è stato aggiunto etanolo assoluto.
B. Il tampone di eluizione è un 0.1x soluzione TE contenente una quantità minima di EDTA. Se l'EDTA influisce sugli esperimenti successivi, si consiglia di sostituire il tampone di eluizione con acqua deionizzata sterile.
- Elaborazione del campione:
UN. Tessuto: Se i materiali freschi non possono essere utilizzati immediatamente, metterli in azoto liquido e conservarli a -80°C. I materiali essiccati possono essere conservati a temperatura ambiente. Macinare 30~80 mg di tessuto in azoto liquido e aggiungere 1 ml di tampone Trizol per l'omogeneizzazione.
B. Cellule in coltura monostrato: Aspirare il terreno di coltura e aggiungere 1 ml di tampone Trizol per l'omogeneizzazione.
C. Sospensione cellulare: Centrifugare per raccogliere le cellule e aggiungerle 1 ml di tampone Trizol per l'omogeneizzazione.
2. Dopo aver aggiunto Tampone Trizol al campione, mescolare accuratamente pipettando, consentire la lisi completa del campione, e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
3. Aggiungere cloroformio in un rapporto di 200 ml al 1 ml di tampone Trizol, agitare vigorosamente per 30 secondi, e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
4. Centrifugare il lisato a 4°C, 12,000 giri al minuto per 10 minuti. L'RNA sarà presente nella fase acquosa superiore.
5. Trasferire con attenzione il surnatante in una nuova provetta da centrifuga, evitando la raccolta degli strati centrali e inferiori. (Nota: Circa 400 È possibile trasferire μl di liquido, che può essere inferiore per alcune specie.)
6. Aggiungere un volume uguale di etanolo assoluto preraffreddato, mescolare velocemente. (Per esempio, aggiungere 400 ml di lisato, aggiungere 400 ml di etanolo assoluto. Se il volume del lisato è inferiore a 400 ml, ridurre proporzionalmente la quantità di etanolo assoluto. Dopo l'aggiunta di etanolo può formarsi un leggero precipitato, ma non influisce sugli esperimenti successivi.)
7. Trasferire il liquido ottenuto in una colonna di purificazione dell'RNA (circa 650-700 ml alla volta), centrifugare a più di 8,000 giri al minuto per 1 minuto, scartare i rifiuti raccolti, e reinserire il tubo di raccolta nella colonna di purificazione per il passaggio successivo.
8. Ripeti il passaggio 7, aggiungendo il liquido rimanente alla colonna di purificazione dell'RNA, centrifugare a più di 8,000 giri al minuto per 1 minuto, eliminare i rifiuti e il tubo di raccolta.
9. Posizionare la colonna di purificazione dell'RNA in una nuova provetta di raccolta, aggiungere 300 μl di tampone di rimozione degli inibitori, centrifugare a più di 8,000 giri al minuto per 1 minuto, scartare i rifiuti, e reinserire la colonna di purificazione dell'RNA nella provetta per il passaggio successivo.
10. Aggiungere 80 ml di DNasi Isoluzione funzionante per la colonna di purificazione dell'RNA, incubare a una temperatura compresa tra 20°C e 30°C per 15 minuti. (Preparare la soluzione di lavoro DNasi I: 62 μl di acqua priva di RNasi, 8 μl 10× tampone di reazione, E 10 µl di DNasi I, rimediare 80 μl di soluzione di lavoro DNasi I.)
11. Aggiungere 300 μl di tampone di rimozione degli inibitorialla colonna di purificazione dell'RNA, centrifugare a più di 8,000 giri al minuto per 1 minuto, scartare i rifiuti, e reinserire la colonna di purificazione dell'RNA nella provetta per il passaggio successivo.
12. Aggiungere 700 ml di tampone di lavaggio 1alla colonna di purificazione dell'RNA, centrifugare a 14,000 giri/min (20,000× g) per 2 minuti, prolungare il tempo di centrifugazione se necessario per una membrana più asciutta. (Nota: Confermare l'aggiunta di etanolo al tampone di lavaggio 1; la presenza di etanolo influenza significativamente gli esperimenti successivi. Assicurarsi che la membrana sia asciutta dopo la centrifugazione prima dell'eluizione. Eliminare i rifiuti e il tubo di raccolta. Dopo aver utilizzato il tampone di lavaggio 1, la membrana sulla colonna di purificazione dell'RNA dovrebbe avere solo un leggero colore. Rimuovere con attenzione la colonna di purificazione dell'RNA dopo la centrifugazione, assicurandosi che non tocchi la provetta di raccolta per evitare la contaminazione da etanolo.)
13. Posizionare la colonna di purificazione dell'RNA in una nuova provetta da centrifuga, gocciolare 100 μl di tampone di eluizionesulla membrana, incubare a temperatura ambiente per 5 minuti (15da °C a 25 °C), e centrifugare a più di 8,000 giri al minuto per 1 minuto. (Nota: Eluizione dell'RNA con 50 μl di tampone di eluizione può aumentare la concentrazione di RNA ma diminuire la resa totale di RNA.)
14. Ripeti il passaggio precedente. (Nota: È possibile utilizzare una nuova provetta da centrifuga per raccogliere l'RNA eluito la seconda volta oppure continuare a utilizzare la provetta di raccolta originale per raccogliere l'RNA.)
Recensioni
Non ci sono ancora recensioni.