Solarbio succinato deidrogenasi (SDH) Kit di analisi dell'attività

Succinato deidrogenasi (SDH) Kit di analisi dell'attività

Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test.

Apparecchiature di rilevamento: Spettrofotometro

Gatto n: BC0950

Misurare: 50T/48S

Componenti

Reagente I: 60 ml×1, conservare a -20 ℃. Reagente II: 0.6 ml×1, conservare a -20 ℃. Reagente III: 5 ml×1, conservare a 4 ℃.

Reagente IV: Polvere×1, conservare a 4 ℃. Quando verrà utilizzata la soluzione, aggiungerlo al Reagente III per dissolverlo per l'uso.

Reagente V: Polvere×1, conservare a 4 ℃. Aggiungere 4 mL di acqua distillata quando verrà utilizzata la soluzione, i reagenti non utilizzati vengono conservati a 4℃.

Reagente VI: Polvere×1, conservare a -20 ℃. Aggiungere 3.333 mL di acqua distillata quando verrà utilizzata la soluzione, i reagenti non utilizzati vengono conservati a 4℃.

Descrizione

Succinato deidrogenasi (SDH, CE 1.3.5.1) è ampiamente presente negli animali, impianti, microrganismi e cellule in coltura. L'SDH è un enzima marcatore dei mitocondri, che è un enzima legante la membrana situato nella membrana interna dei mitocondri. È anche uno dei punti chiave del trasferimento di elettroni respiratori e della fosforilazione ossidativa. Inoltre, fornisce elettroni per la catena respiratoria di varie cellule procariotiche.

L'SDH può catalizzare la deidrogenazione dell'acido succinico in acido fumarico. La deidrogenazione può ridurre il 2,6-diclorofenolo indofenolo (DCPIP) sotto il trasferimento di fenazina dimetilsolfato (sindrome premestruale). 2,6- DCPIP ha un picco di assorbimento caratteristico a 600 nm. Il tasso di riduzione del 2,6-DCPIP è determinato dalla variazione dell'assorbanza a 600 nm, che rappresenta l'attività dell'enzima SDH.

Obbligatorio ma non fornito

Spettrofotometro, bagnomaria, centrifuga da tavolo, pipetta regolabile, mortaio/omogeneizzatore, 1 Cuvetta di vetro da ml, ghiaccio e acqua distillata.

Protocollo

IO. Estrazione dell'SDH:

Pesare accuratamente 0.1 g di tessuto o raccogliere 5 milioni di cellule, aggiungere 1 mL di Reagente I e 10 μL di Reagente II, omogeneizzare utilizzando un omogeneizzatore/malta in un bagno di ghiaccio, macinare completamente, centrifugare a 11000 ×g per 10 minuti a 4 ℃, prendi il surnatante e mettilo sul ghiaccio per il test.

II. Procedura

1. Preriscaldare lo spettrofotometro per 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda su 600 nm e azzerare con acqua distillata.
2. Prova di procedura

Aggiungere ciascun reagente a 1 ml di cuvetta di vetro a turno, e avviare il cronometraggio contemporaneamente all'aggiunta del Reagente VI, registrare l'assorbanza iniziale A1 alla lunghezza d'onda di 600 nm per 20 secondi. Quindi mettere la cuvetta insieme alla soluzione di reazione in un bagnomaria a 37℃ (mammifero) o 25 ℃ (altre specie), e reazione accurata per 1 minuto. Estrarre rapidamente la cuvetta e asciugarla, e registrare l'assorbanza A2 a 80 secondi a 600 nm. ΔA = A1-A2, ottenere ΔAT, ΔAB.

III. Calcolo dell'SDH attività

Formula di calcolo per la determinazione con 1 Cuvetta di vetro da ml.

• Concentrazione proteica

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza il consumo 1 nmol di 2,6-diclorofenolo indofenolo al minuto nel sistema di reazione ogni milligrammo di proteina tissutale.

SDH(U/mg prot)＝[(ΔAT-ΔAB)÷(ε×d)×VRV×109]÷(Cpr×VS) ÷T＝1555.556×(ΔAT-ΔAB)÷Cpr

• Peso del campione

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza il consumo 1 nmol di 2,6-diclorofenolo indofenolo al minuto nel sistema di reazione per ogni grammo di tessuto.

SDH(U/g)＝[(ΔAT-ΔAB)÷(ε×d)×VRV×109]÷(VS÷VST×W) ÷T＝1571.111×(ΔAT-ΔAB)÷W

• Germe o cellule

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza il consumo 1 nmol di 2,6-diclorofenolo indofenolo al minuto nel sistema di reazione ogni 10 migliaia di germi o cellule.

SDH(Cella U/104)＝[(ΔAT-ΔAB)÷(ε×d)×VRV×109]÷(VS÷VST×500) ÷T

＝3.142×(ΔAT-ΔAB)

VRT: Volume totale di reazione, 0.98×10-3 litri;

e: Il coefficiente di estinzione molare del 2,6-DCPIP, 2.1×104 L/mol/cm; D: Il diametro leggero della cuvetta, 1 cm;

Contro: Volume del campione, 0.03 ml;

VST: Aggiungere il volume del Reagente I e del Reagente II, 1.01 ml; T: Tempo di reazione(min), 1 minuto;

Cpr: Concentrazione proteica del campione, mg/ml; W: Peso del campione, G;

500: Cellule o germe, 5 milioni.

Nota

1. Tutti i reagenti e i campioni devono essere posti nel ghiaccio durante la determinazione per evitare la denaturazione e la disattivazione.
2. Se ΔA è maggiore di 0.5, la soluzione enzimatica deve essere diluita con l'estratto enzimatico per ottenere ΔA con meno di 0.5, che può migliorare la sensibilità di rilevamento.
3. Perché la soluzione Estratto contiene una certa concentrazione di proteine (Di 1 mg/ml), è necessario sottrarre il contenuto proteico della soluzione Extract stessa quando si determina la concentrazione proteica del campione.

Esempio sperimentale:

1. Prendi 0,1 g di rene, aggiungere 1 mL di Reagente Ⅰ e 10 μL di reagente Ⅱ, macinare l'omogeneizzato con un bagno di ghiaccio, centrifugare a 4 ℃ e 11000 g per 10 min, e posizionare il surnatante sul ghiaccio. Secondo la procedura di determinazione, l'attività enzimatica viene calcolata come segue: ΔAT= A1T- A2T=0,82-0,681=0,139, ΔAB=A1B- A2B=905-0,904=0,001

Attività SDH (Massa U/g) = 961.905×(ΔAT- ΔAB) ÷ W =2168,13 U/g massa.

Riferimenti

• Fattoretti P, Bertoni-Freddari C, Caselli U, et al. Attività compromessa della deidrogenasi succinica dei mitocondri delle cellule di Purkinje del ratto durante l'invecchiamento[J]. Meccanismi di invecchiamento e sviluppo, 1998, 101(1-2): 175- 182.

prodotti correlati

BC0710/BC0715 α-chetoglutarato deidrogenasi(α-KGDH) Kit di analisi dell'attività

BC2150/BC2155 Acido Citrico(circa) Kit di analisi del contenuto

BC0380/BC0385 Piruvato deidrogenasi(PDH) Kit di analisi dell'attività