Solarbio ribulosio 1 5-bisfosfato carbossilasi/ossigenasi (Rubisco) Kit di analisi

Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test.

Attrezzatura operativa: Spettrofotometro

Gatto n: BC0440

Misurare:50T/48S

Componenti:

• Ribulosio 1,5-bifosfato carbossilasi/ossigenasi (Rubisco) è un enzima chiave nella fotosintesi delle piante.
• Controlla la fissazione dell'anidride carbonica e regola il flusso di carbonio nel ciclo di Calvin e nel ciclo di fotorespirazione.
• L'attività di Rubisco influenza direttamente il tasso fotosintetico.
• Rubisco catalizza la combinazione di ribulosio-1,5-difosfato (RuBP) e anidride carbonica per produrre 3-fosfoglicerato (PGA).
• Il PGA viene ulteriormente convertito in gliceraldeide-3-fosfato, accompagnato dall'ossidazione del NADH per formare NAD+.
• Il NADH assorbe la luce a 340 nm, mentre NAD+ no.
• In questo kit, L'attività di Rubisco viene determinata misurando la diminuzione dell'assorbanza del NADH a 340 nm.

Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti:

Spettrofotometro ultravioletto, centrifuga da tavolo, pipetta regolabile, bagnomaria, 1 Cuvetta in quarzo da ml, mortaio/omogeneizzatore, ghiaccio, acqua distillata.

Procedura:

Preparazione del campione:

• • Batteri o cellule:
    • Raccogliere i batteri o le cellule in una provetta da centrifuga e centrifugare per eliminare il surnatante.
    • Aggiungere 1 ml di soluzione di estratto a 5 milioni di batteri o cellule.
    • Usa gli ultrasuoni (sul ghiaccio, 20% energia, 3 secondi dopo, 10 secondi liberi, ripetuto 30 volte) per lisare batteri o cellule.
    • Centrifugare a 10000 ×g per 10 minuti a 4°C per rimuovere i materiali insolubili e raccogliere il surnatante su ghiaccio per l'analisi.
  • Tessuto:
    • Aggiungere 1 ml di soluzione di estratto a 0.1 g di tessuto (preferibilmente campioni di piante fresche) e omogeneizzare su ghiaccio.
    • Centrifugare a 10000 ×g per 10 minuti a 4°C per rimuovere i materiali insolubili, e raccogliere il surnatante sul ghiaccio per il test.

Procedura di determinazione:

• • • • Preriscaldare lo spettrofotometro UV per 30 minuti e regolare la lunghezza d'onda su 340 nm. Azzerare lo strumento con acqua distillata.
      • Aggiungere i seguenti reagenti:

Reagente (μL)	Provetta (T)	Tubo vuoto (B)
Campione	100	–
acqua distillata	–	100
Reagente III	35	35
Reagente IV	35	35
Soluzione funzionante	900	900

Rilevare l'assorbanza a 340 nm al momento degli anni '20 e 5 minuti e 20 secondi, registrare rispettivamente come A1 e A2. ΔA(T)=A2(T)-A1(T), ΔA(B)=A2(B)-A1(B), ΔA=ΔA(T)-ΔA(B). Mantenuto a 25 ℃ durante la reazione. I tubi vuoti devono essere testati solo una o due volte.

Calcolo:

Esempio sperimentale:

Prendi 0,1 g di foglie di piante, aggiungere 1 ml di soluzione di estratto per omogeneizzazione, prendi il surnatante, e quindi operare secondo le fasi di determinazione.

Misurare con microcuvetta al quarzo e calcolare

ΔAT= AT1-AT2=1,279-1,206=0,073, ΔAB=AB1–AB2=0,834-0,823=0,011,

ΔA= ΔAT -ΔAB=0,073-0,011=0,062

Attività Rubisco (Massa U/g) = 344 × ΔA ÷ W =344×0,062÷0,1=213,28 U/g massa.

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