Glutatione ridotto (GSH) Kit di analisi del contenuto
Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test.
Attrezzatura operativa: Spettrofotometro/lettore di micropiastre
Numero di catalogo: BC1175
Misurare: 100T/96S
Componenti:
Reagente I: 100 ml×1. Conservare a 4 ℃.
Reagente II: 20 ml×1. Conservare a 4 ℃.
Reagente III: 8 ml×1. Conservare a 4 ℃, proteggere dalla luce.
Standard: Polvere 10 Mg × 1. Conservare a 4 ℃, proteggere dalla luce.
Descrizione del prodotto
Il glutatione è un tripeptide naturale composto da acido glutammico (Glu), cisteina (Cys) e glicina (Gly). È una specie di composto contenente il gruppo solfidrilico (-SH), che esiste ampiamente nel tessuto animale, tessuto vegetale, microrganismo, e lievito. Il glutatione può reagire con 5,5′-dithiobis-(2-acido nitrobenzoico) (Dtnb) per produrre acido 2-nitro-5-mercaptobenzoico e disolfuro di glutatione (GSSG). 2-L'acido nitro-5-mercaptobenzoico è un prodotto giallo, con il massimo assorbimento a 412 nm.
Specifiche tecniche
Limite di rilevamento minimo：3.763 μg/ml
Gamma lineare：12.5-400 μg/ml
Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti
Equilibrio analitico, mortaio/omogeneizzatore, centrifuga a bassa temperatura, bagnomaria, pipetta regolabile, Spettrofotometro/lettore di micropiastre, micro cuvetta di vetro o 96 Bene piatto a fondo piatto e acqua distillata.
Procedura
IO. preparazione del campione
- Campione di tessuto
Lavare i tessuti freschi con PBS per due volte, quindi aggiungi 0.1 g di tessuto animale/vegetale in omogeneizzatore (L'omogeneizzatore è stato sciacquato con il reagente I e posto sul ghiaccio prima dell'uso). Aggiungere 1 ml di reagente I (La proporzione di tessuto e reagenti può essere mantenuta costante), macinazione completa su ghiaccio (L'uso dell'azoto liquido avrà un migliore effetto di macinazione). Centrifugare a 8000 ×g per 10 minuti a 4 ℃, Prendi il surnatante e mettilo a 4 ℃ per il test. (Se il test non può essere completato temporaneamente, Il surnatante può essere conservato a -80 ℃ per 10 giorni.)
- Campione di sangue
Plasma: Il campione è centrifugato a 600 ×g per 10 minuti a 4 ℃. Assorbendo il plasma superiore in un altro tubo con l'aggiunta dello stesso reagente di volume i. Centrifugare a 8000 ×g per 10 minuti a 4 ℃, Prendi il surnatante e mettilo a 4 ℃ per il test. (Se il test non può essere completato temporaneamente, Il surnatante può essere conservato a -80 ℃ per 10 giorni.)
Cellule del sangue: Il campione è centrifugato a 600 ×g per 10 minuti a 4 ℃. Scartare il plasma superiore, Lavare con tre volte volume di PBS per 3 volte (Sospensa nuovamente le cellule del sangue con PBS, centrifugare a 600 ×g per 10 minuti), Aggiungi uguale volume di reagente i. Dopo aver mescolato, è posizionato a 4 ℃ per 10 minuti. Centrifugare a 8000 ×g per 10 minuti, Prendi il surnatante e mettilo a 4 ℃ per il test. (Se il test non può essere completato temporaneamente, Il surnatante può essere conservato a -80 ℃ per 10 giorni.)
3. Cella campione
La raccolta delle cellule non dovrebbe meno di 106, quindi lavarlo con PBS per due volte (Re-sospendere la cella con PBS, centrifugare a 600 ×g per 10 minuti). Il volume del reagente che ho aggiunto è tre volte il volume della precipitazione cellulare per sostenere nuovamente le cellule. Ripetuti congelamento e scongelamento 2-3 volte (Si suggerisce che congelato in azoto liquido, sciolto in 37 ℃ bagni d'acqua). Centrifugare a 8000 ×g per 10 minuti, Prendi il surnatante e mettilo a 4 ℃ per il test. (Se il test non può essere completato temporaneamente, Il surnatante può essere conservato a -80 ℃ per 10 giorni.)
II. Procedura
- Preriscaldare lo spettrofotometro/lettore di micropiastre per 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda su 412 nm, azzerare con il distillato
- Preriscaldamento del reagente II in 37 ℃ (cellula di mammifero) o 25 ℃ (altre specie) bagnomaria per 30
- Determinazione del tubo vuoto: Prendi micro cuvetta, aggiungere 20 µl di acqua distillata, 140 μL di Reagente II, 40 μl di reagente III a sua volta, mescolare bene, posto per 2 minuti, e misura 412 Nm Assorbance AB.
- Fare curva standard
Pesare 1 mg di standard e dissolverlo con 1 ml di acqua distillata per ottenere la concentrazione di 1 mg/ml. Prendere la soluzione appropriata per preparare gli standard con la concentrazione di 200 μg/ml, 100 μg/ml, 50 μg/ml, 25 μg/ml e 12.5 μg/ml (Diluire il reagente I dieci volte prima di diluire la soluzione standard).
Prendere un 1.5 ML EP Tube e Aggiungi 20 μL di standard, 140 μl di reagente II e 40 μl di reagente III a sua volta. Dopo che ogni tubo è uniformemente miscelato, è permesso di sopportare 2 minuti. Misurare l'assorbanza a 412 nm, e assorbanza meno ab come ascissa. Crea la curva standard in base all'assorbanza (X) e concentrazione (y, μg/ml).
- Test del tubo campione: Prendi micro cuvetta, aggiungere 20 μL di campione, 140 μL di Reagente II, 40 μl di reagente III a sua volta, mescolare bene, e poi sopportare 2 minuti per testare l'assorbanza atat 412 nm, ΔA = At – AB.
- Il funzionamento del lettore di micropiastre è uguale a quello dello spettrofotometro, e l'operazione è veloce come
III. Calcoli
Secondo la curva standard, Prendi il campione ΔA nella formula(X), e calcola la concentrazione del campione y (μg/ml).
- Concentrazione proteica
GSH (μg/mg Prot)= y × vrv ÷ vrv ÷ cpr = y ÷ cpr
- Peso del campione
GSH (μg/g)= y × vrv ÷(VRV ÷ vsv × w)= y ÷ w
- Quantità di celle
GSH (μg/104cell)= y × vrv ÷(VRV ÷ vsv × n)= y ÷ n
- Volume della soluzione GSH (μg/ml)= 2y
N: Quantità di celle, 106;
Vsv: Volume totale del surnatante, 1 ml；
la corda: Volume di surnatante aggiunto nel sistema di reazione, 20 μl = 0,02 ml； W: Peso del campione, G;
Cpr: Concentrazione proteica nel surnatante, mg/ml.
2: Il volume del plasma (cellule del sangue) è diluito da una volta.
Nota:
- Il campione deve essere completamente omogeneizzato. Se il test non può essere completato temporaneamente, Può essere conservato AT-80 ℃.
- Standard: Il glutatione ridotto viene preparato quando la soluzione sarà
- Se il contenuto GSH nel campione è incerto, Diluire il campione per diversi gradienti prima
- Perché il reagente contengo precipitante proteico, Il surnatante non può essere usato per la determinazione della concentrazione di proteina. Se è necessario determinare il contenuto proteico, Prendi un altro tessuto.
Riferimento:
- Alpert a j, Gilbert H f. Rilevazione di glutatione ossidato e ridotto con una reazione postcolumn di riciclaggio[J]. Biochimica analitica, 1985, 144(2):553-562.
- Owens c w i, Belcher R v. Un micro-metodo colorimetrico per la determinazione del glutatione[J]. Diario biochimico, 1965, 94(3):
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