Solarbio piruvato carbossilasi (computer) Kit di analisi dell'attività

Piruvato carbossilasi (computer) Kit di analisi dell'attività

Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test.

Attrezzatura operativa: Spettrofotometro

Gatto n: BC0730

Misurare:50T/48S

Componenti:

Estrarre la soluzione: Liquido 110 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente I: Liquido 30 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente II: Liquido 10 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente III: Polvere×1. Conservazione a -20 ℃. Sciogliere con 5 mL di acqua distillata, conservare a -20℃ dopo la preparazione.

Reagente IV: Polvere×1. Conservazione a -20 ℃. Sciogliere con 5 mL di acqua distillata, conservare a -20℃ dopo la preparazione.

Reagente V: Liquido 5 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente VI: Liquido 15 μL×1. Conservazione a 4 ℃.

Soluzione diluente del reagente VI: Liquido 10 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Descrizione del prodotto:

Piruvato carbossilasi (computer, CE 6.4.1.1) è ampiamente presente nei mitocondri degli animali, muffe e lievito, ma non si trova nelle piante e nella maggior parte dei batteri. Il PC è la principale postreazione dell'ossalacetato, ed è di prim'ordine- enzima limitante nel processo di gluconeogenesi.

Il PC catalizza irreversibilmente il piruvato, ATP, CO2 e acqua a ossalacetato, ADP e Pi, la deidrogenasi malica catalizza ulteriormente la formazione di acido malico e NAD+ da acido acetoacetico e NADH. L'attività enzimatica del PC può essere riflessa rilevando il tasso di ossidazione del NADH a 340 nm.

Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti:

Spettrofotometro ultravioletto, bagnomaria, centrifuga da tavolo, bagnomaria, pipetta regolabile, 1 Cuvetta in quarzo da ml, mortaio/omogeneizzatore, ghiaccio e acqua distillata.

Procedura:

IO. Estrazione complessa:

• Collezionare 0.1 g di tessuto o 5 milioni di cellule, aggiungere 1 ml di soluzione di estratto, macinazione su ghiaccio con mortaio/omogeneizzatore.
• Centrifugare a 1000 ×g per 10 minuti a 4 ℃,
• Portare il surnatante nell'altra provetta e centrifugare 11000 ×g per 15 minuti a 4 ℃.
• Il surnatante viene utilizzato per rilevare la fuoriuscita di PC dai mitocondri, che mostra l'effetto dell'estrazione mitocondriale.
• Aggiungere 1 mL di soluzione di estratto nel sedimento, spaccatura con ultrasuoni (energia 20%, tempo di lavoro 5s, intervallo 10s, ripetere 12 volte), utilizzato per rilevare l'attività enzimatica del PC e il contenuto proteico.

II. Determinazione procedura:

• Preriscaldare lo spettrofotometro ultravioletto per 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda su 340 nm, azzerare con acqua distillata.
• Preriscaldare il reagente I a 37℃ per 15 minuti.
• Diluente il Reagente VI in base al rapporto in volume del Reagente VI: Soluzione Diluente Reagente VI = 1.6:660(V:V), preparare il reagente quando verrà utilizzato.
• Soluzione funzionante: preparare la soluzione come rapporto in volume del Reagente II: Reagente III: Reagente IV= 2:1:1, preparare il reagente quando verrà utilizzato.
• Aggiungere i seguenti reagenti 1 Cuvetta in quarzo da ml:

III. Calcolo:

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che ne catalizza la produzione 1 nmol di NADH al minuto per ogni milligrammo di proteine.

Attività del PC(U/mg prot)=[ΔA×Vrv÷(ε×d)×109]÷(Vs×Cpr)÷T =1607×ΔA÷Cpr

e: Coefficiente di estinzione molare del NADH, 6.22×103 L/mol/cm; D: Percorso luminoso della cuvetta, 1 cm;

Corda: Volume totale di reazione,1×10-3 litri; Contro: Volume del campione (ml), 0.05 ml;

Cpr: Concentrazione proteica del campione (mg/ml); T: Tempo di reazione (min), 2 minuti;

109: 1 mol=109 nmol.

Nota:

1. Prendi uno o due campioni diversi per la previsione prima del test. Si consiglia di diluire la soluzione dell'enzima grezzo con la soluzione dell'estratto prima della determinazione del ΔA>0.8(se si misura con 96 piastra UV ben piatta, ΔA>0.5). Mentre, allungando i tempi di risposta (5 minuti o 10 minuti) se ΔA <0.01.

2. Il tubo vuoto è un foro di rilevamento per rilevare la qualità di ciascun componente del reagente, e normalmente che la variazione di ΔAB non superi 0.05.
3. La concentrazione proteica del campione deve essere determinata dall'utente. Poiché la soluzione di estratto contiene una concentrazione proteica relativamente elevata (Di 1 mg/ml), la concentrazione proteica della soluzione Extract deve essere detratta quando si misura la concentrazione proteica del campione.

4. Si consiglia di utilizzare la concentrazione proteica del campione per calcolare l'attività enzimatica. Se per il calcolo viene utilizzato il peso fresco del campione, è necessario misurare l'attività enzimatica dell'estratto citoplasmatico, e la somma dell'attività enzimatica del surnatante e della precipitazione costituisce l'attività enzimatica totale.
5. I reagenti contenuti in questo kit sono sufficienti per completare 50 reazioni del tubo.
6. Appendice: formula di calcolo del peso del campione: (il numero del test del campione è 50T/24S)

1) Supernatante:

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è la quantità di enzima che ne catalizza la produzione 1 nmol di NADH al minuto per ogni grammo di tessuto.

Attività del PC (Peso U/g) =[ΔA1×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷T =1607×ΔA1÷W

ΔA1: Assorbimento del surnatante;

e: Coefficiente di estinzione molare del NADH, 6.22×103 L/mol/cm; D: Percorso luminoso della cuvetta, 1 cm;

Corda: Volume totale di reazione,1×10-3 litri; Contro: Volume del campione (ml), 0.05 ml; Ve: Soluzione di estrazione, 1 ml;

Cpr: Concentrazione proteica del campione (mg/ml); T: Tempo di reazione (min), 2 minuti;

109: 1 mol=109 nmol;

W: Peso del campione, G.

2) Sedimento:

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è la quantità di enzima che ne catalizza la produzione 1 nmol di NADH al minuto per ogni grammo di tessuto.

Attività del PC (Peso U/g) =[ΔA2×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷T =1607×ΔA2÷W

ΔA2: Assorbimento dei sedimenti;

e: Coefficiente di estinzione molare del NADH, 6.22×103 L/mol/cm; D: Percorso luminoso della cuvetta, 1 cm;

Corda: Volume totale di reazione,1×10-3 litri; Contro: Volume del campione (ml), 0.05 ml;

Ve: Volume di sospensione pesante del sedimento, 1 ml; Cpr: Concentrazione proteica del campione (mg/ml); T: Tempo di reazione (min), 2 minuti;

109: 1 mol=109 nmol;

W: Peso del campione, G.

3) Totale attività

L'attività totale è la somma dell'attività del PC nel surnatante e nel sedimento. computer(Peso U/g)=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W.

Esempio sperimentale:

1. 1 Viene aggiunto mL di soluzione di estratto 0.1 g di tessuto cardiaco di coniglio per l'omogeneizzazione. Il surnatante viene diluito 100 volte con la soluzione Extract, e la precipitazione è stata diluita 4 volte. Poi, misurato mediante piastra al microquarzo secondo le fasi di determinazione, Supernatante: il ΔAT = A1T – A2T= 1.104-0.856 =0,248, ΔAB = A1B – A2B = 1,021-0,988 = 0,033, ΔA1 = ΔAT – ΔAB = 0,248-0,033=0,215, precipitato: ΔAT = A1T – A2T= 1.07-0.716 =0,354, ΔAB=A1B- A2B = 1,021-0,988 = 0,033, ΔA2 = ΔAT- ΔAB =0,354-0,033= 0.321

Supernatante: l'attività del PC (Massa U/g) = 1607 × Δ A1 ÷ L × 100 (rapporto di diluizione) = 1607×0,215÷0,1× 100 = 345505 Massa U/g;

Precipitazione: l'attività enzimatica del PC (Massa U/g) = 1607×ΔA2 ÷ L×4 (rapporto di diluizione) = 1607×0,321÷ 01.

× 4=20633,88 U/g di massa;

L'attività enzimatica totale del PC (Massa U/g) = 1607×ΔA1÷L×100 (diluizione) + 1607×ΔA2 ÷ W

=1607× 0.215 ÷0,1×100+1607×0,321÷0,1×4=366138,88 U/g massa.

Riferimenti

[1] Esmail S. Kakey,Amez A. Ismael. Valutazione dello stato di stress ossidativo nell'uomo anziano in relazione ad alcune malattie. Convegno internazionale sulle scienze pure e applicate. agosto 2018;

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