Solarbio Pyrophosphate: Fructose 6-phosphate-1 Phosphotransferase Assay Kit

Attributo	Dettagli
Nota	Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test
Strumento di rilevamento	Spettrofotometro
Gatto n	BC3400
Misurare	50T/48S

Componenti:

Estrarre la soluzione: 55ml× 1, conservato a 4 °C.

Reagente 1: 40ml× 1, conservato a 4 °C and protected from light.

Reagente 2: Polvere × 1, conservato a -20 °C and protected from light. Just before use, aggiungere 6 mL di acqua distillata per scioglierlo completamente. Unused reagents are stored at -20 °C per 1 week after dispensing to avoid repeated freeze-thaw cycles.

Reagente 3: powder × 1, conservato a -20 °C and protected from light. Just before use, aggiungere 6 mL di acqua distillata per scioglierlo completamente. Unused reagents are stored at -20 °C after dispensing. Prohibition of repeated freeze-thaw cycles.

Reagente 4: 91µL × 2, conservato a 4 °C and protected from light. Just before use, aggiungere 0.209 mL di acqua distillata per scioglierlo completamente. Stored at 4 °C per 1 settimana.

Reagente 5: Polvere × 2, conservato a -20 °C and protected from light. Just before use, aggiungere 0.3 mL di acqua distillata per scioglierlo completamente. Unused reagents are stored at -20 °C per 1 week after dispensing.

Reagente 6: 60 µL × 1, conservato a 4 °C and protected from light. Just before use, aggiungere 0.6 mL di acqua distillata per scioglierlo completamente. Stored at 4 °C per 1 settimana.

Descrizione del prodotto:

Pyrophosphate: Fructose-6-phosphate-1-phosphotransferase (PFP, EC2.7.1.90) is a cytosolic enzyme that is widely present in plant tissues and catalyzes the phosphorylation of fructose-6-phosphate like phosphofructokinase. As a result, the single PEP catalytic reaction is a reversible reaction, and pyrophosphate is used instead of ATP, which plays an important role in carbon metabolism of photosynthesis.

PFP catalyzes the conversion of fructose 6-phosphate to fructose 1,6-diphosphate, which is converted to dihydroxyacetone phosphate by the action of aldolase and triose phosphate isomerase, and then catalyzed by α-phosphate glycerol dehydrogenase and NADH to from Glycerol 3-diphosphate and NAD. The change in absorbance at 340 nm reflects the level of PFP activity.

Materiale richiesto

Low temperature centrifuge, spettrofotometro, water bath/constant temperature incubator, mortaio/omogeneizzatore, 1 Cuvetta in quarzo da ml, pipetta di trasferimento, ghiaccio e acqua distillata, Tubo EP.

Procedura:

IO. Campione Estrazione:

1. 1. Campione di tessuto:

Secondo la massa del tessuto (G): the volume of the extract solution (ml) È 1: 5 ~ 10. Suggested 0.1g of tissue with 1mL of extract solution. Macinare completamente sul ghiaccio, centrifugated at 20000g and 4℃ for 15 min. Il surnatante viene posto sul ghiaccio per il test.

2. Batteri o cellule:

Secondo il numero di celle (104): the volume of the extract solution (ml) È 500 ~ 1000: 1. Consiglia 5 million with 1mL of Extract Solution. Utilizzare gli ultrasuoni per dividere batteri o cellule (power 300W, tempo di lavoro 3 secondi, intervallo 7s, tempo totale 3 min). Centrifugated at, 20000ge 4℃ per 15 min. Il surnatante viene posto sul ghiaccio per il test.

3. Liquids: direct detection.

II. Determinazione procedura:

• Preriscaldare lo spettrofotometro 30 min, regolare la lunghezza d'onda su 340 nm, azzerare con il distillato
• Aggiungere i reagenti con il seguente elenco:

Nome del reagente (μL)	Provetta (T)	Tubo vuoto (T)
Reagente 1	670	670
Reagente 2	100	100
Reagente 3	100	100
Reagente 4	10	10
Reagente 5	10	10
Reagente 6	10	10
Campione	100	–
Acqua distillata	–	100
Dopo un'accurata miscelazione, measure the initial value A1 at 340 nm and the absorbance A2 for 30 minuti a 37 °C in a 1 Cuvetta in quarzo da ml, and record them as A1T, A1b, and A2T, A2B. Calculate ΔA = (A1T-A2T)- (A1B-A2B). Nota: Reagenti 1, 2, 3, 4, 5, E 6 can also be formulated into working fluids according to the proportions of the operation table, which is now prepared for use; The blank tubes need only be made 1–2 times.

III. Calculation of PFP attività:

1 Calcolato mediante microcuvetta al quarzo

• Calcolato dalla concentrazione proteica:

Definizione di unità: One unit of enzyme activity is defined as that 1 mg of tissue protein per minute consumes 1 nmol of NADH.

PFP activity (U/mg prot) =ΔA÷（ε×d）×VRT×109÷(VS×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr

• Calcolato in base al peso del campione

Definizione di unità: One unit of enzyme activity is defined as that 1g of tissue per minute consumes 1 nmol of NADH.

PFP activity (U/g peso fresco) =ΔA÷（ε×d）×VRT×109÷(W ×VS÷VE) ÷T=53.59×ΔA÷W

• Calcolato in base ai batteri o alla quantità di cellule:

Definizione di unità: One unit of enzyme activity is defined as that 10 thousand bacteria or cells per minute consumes 1 nmol of NADH.

PFP activity (Cella U/104) =ΔA÷（ε×d）×VRT×109÷(VS×N÷VE) ÷T=53.59×ΔA÷N（104）

• Calculated by serum and other liquids:

Definizione di unità: One unit of enzyme activity is defined as that 1 mL of liquids per minute consumes 1 nmol of NADH.

PFP activity (U/ml) =ΔA÷（ε×d）×VRT×109÷VS÷T=53.59×ΔA

VRT: total volume of reaction system, 0.001 l;

e: Coefficiente di estinzione molare del NADH, 6.22 × 103 L/mol/cm; D: cuvette light path, 1 cm;

VS: added sample volume, 0.1 ml;

VE: volume of extract solution added, 1 ml; T: tempo di reazione, 30 min;

Cpr: concentrazione delle proteine ​​del campione, mg/ml; W: massa del campione, 0.1 G;

109:fattore di conversione, 1 moli = 109 nmol N: number of cell

2. Calculated by 96-well UV plate:

Modify d = 1 cm in the above formula to d-0.6 cm (the light path of a 96-well plate) for calculation.

Nota:

1. The number of samples should not be too large to avoid delaying the enzymatic reaction time.

Esempi sperimentali:

1. Prendere 0.1 g of bean sprouts and add 1 mL of Extract solution for sample processing. After centrifugation to take the supernatant, procedere secondo la procedura di determinazione. CalculateΔA = (A1T-A2T)-(A1B-A2B)= (1.041-0.963)-0=0.078. The enzyme activity is calculated according to the sample mass.

PFP activity (U/g peso fresco) =53.59×ΔA÷W=41.8 U/g fresh weight.

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