Perossidasi (POD) Kit di analisi dell'attività

Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test.

Attrezzatura operativa: Spettrofotometro Numero di catalogo: BC0090 Dimensioni：50T/48S

Componenti:

Estrarre la soluzione: 60 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente I: 40 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente II: 0.5 ml×1. Conservazione a 4 ℃. Centrifugare prima dell'uso. Prendere 0.22 mL di reagente II e aggiungere 3.33 ml di reagente I, mescolarlo per un uso successivo (circa 27T). Preparatelo per l'uso immediato, oppure può essere preparato in proporzione in base al volume del campione.

Reagente III: 10 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Descrizione del prodotto

Perossidasi (POD, CE 1.11.1.7) è ampiamente presente negli animali, impianti, e microrganismi. Può catalizzare l'ossidazione di fenoli e ammine da parte del perossido di idrogeno, e ha il duplice effetto di eliminare la tossicità del perossido di idrogeno, fenoli, e ammine. In presenza di perossido di idrogeno, Il POD può catalizzare l'H2O2 ossidando substrati specifici per produrre una sostanza che ha un assorbimento 470 nm.

Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti

Spettrofotometro, centrifuga da tavolo, trasferente, 1 Cuvetta di vetro da ml, mortaio/omogeneizzatore, ghiaccio e acqua distillata.

Procedura

IO. preparazione del campione:

UN. Batteri o cellule

Raccolta di batteri o cellule nella provetta da centrifuga, il surnatante viene scartato dopo la centrifugazione. Si consiglia di prendere circa 5 milioni di batteri/cellula e aggiungere 1 ml di soluzione di estratto. I batteri o le cellule vengono divisi mediante ultrasuoni (Energia: 20% O 200 W, tempo di lavoro 3 secondi, intervallo 10s, ripetere per 30 volte). Centrifugare a 8000 giri al minuto e 4 ℃ per 10 minuti, il surnatante viene utilizzato per il test.

B. Tessuto

Si consiglia di prendere circa 0.1 g di tessuto e aggiungere 1 ml di soluzione di estratto, macinazione completa su ghiaccio.

Centrifugare a 8000 giri al minuto per 10 minuti a 4 ℃, il surnatante viene utilizzato per il test.

C. Siero (plasma) campione: Rilevare il campione

II. Determinazione procedura

1. Preriscaldare lo spettrofotometro per 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda su 470 nm, azzerare con il distillato
2. Posizionare il reagente I, Reagente II e Reagente III a 37℃ (mammifero) o 25 ℃(altre specie) per 10 minuti prima
3. Aggiungere i reagenti con il seguente elenco:

Vengono aggiunti i reagenti di cui sopra 1 cuvetta di vetro ml in sequenza, immediatamente miscelato e cronometrato. I valori di assorbanza A1 per 30 se A2 per gli anni '90 a 470 nm vengono registrati, ΔA＝A2-A1.

III. Calcoli

IO. Siero (plasma)campione

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza l'assorbanza di 0.01 cambiare a 470 nm nel sistema di reazione al minuto per ogni millilitro di siero (plasma).

POD(U/ml)=ΔA×Vrv÷Vsv÷0.01÷T =7133×ΔA

II. Tessuto, batteri o cellule di coltura

UN. Concentrazione proteica

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza l'assorbanza di 0.01 cambiare a 470 nm nel sistema di reazione al minuto per ogni milligrammo di proteina.

POD(U/mg prot)＝ΔA×Vrv÷(Vsv×Cpr)÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr

B. Peso del campione

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza l'assorbanza di 0.01 cambiare a 470 nm nel sistema di reazione al minuto per ogni grammo di tessuto.

POD(U/g peso fresco)＝ΔA×Vrv÷(W× Vsv÷Vs)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W

C. Cellmount

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza l'assorbanza di 0.01 cambiare a 470 nm nel sistema di reazione al minuto ogni 10 migliaia di batteri o cellule.

POD(Cella U/104)＝ΔA×Vrv÷(500×Vsv÷Vs)÷0,01÷T =14,27×ΔA

Corda: Volume totale di reazione, 1.07 ml; Vsv: Volume totale del surnatante, 0.015 ml; Contro: Estrarre il volume della soluzione, 1 ml;

T: Tempo di reazione, 1 minuto;

Cpr: Concentrazione proteica del campione, mg/ml; W: Peso del campione, G;

500: Numero totale di batteri o cellule, 5 milioni.

Nota:

1. Se ci sono molti campioni da determinare contemporaneamente, la miscela del Reagente I, II, III e l'acqua distillata possono essere preparate in proporzione, e la miscela può essere posizionata a 37 ℃ (mammifero) o 25 ℃ (altre specie) per più di 10 minuti. 15 μL di campione e 1055 È possibile aggiungere μL di miscela per la determinazione.
2. Se ΔA è inferiore a 0.005, il tempo di reazione può essere esteso a 5 minuti. Se ΔA è maggiore di 0.5 oppure ci sono più bolle nella soluzione di reazione, il campione può essere diluito con l'estratto e determinato, e la formula di calcolo viene moltiplicata per la diluizione corrispondente.
   

   Riferimenti

   • Reuveni R . Attività della perossidasi come marcatore biochimico per la resistenza del melone ( Melone cetriolo ) alla Pseudoperonospora cubensis[J]. Fitopatologia, 1992,82(7).
   • Doerge D R , Divi R L , Churchwell M I . Identificazione del prodotto di ossidazione del guaiacolo colorato prodotto dalle perossidasi[J]. Biochimica analitica, 1997,250(1):10-17.

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