Glutatione ossidato Solarbio (GSSG) Kit di analisi del contenuto

Glutatione ossidato (GSSG) Kit di analisi del contenuto

Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test.

Attrezzatura operativa: Lettore spettrofotometro/micropiastre

Numero di catalogo: BC1185

Misurare:100T/96S

Componenti:

Reagente I:100 ml×1. Conservazione a 4 ℃. Reagente II: 130 μL×1. Conservazione a 4 ℃. Reagente III: 20 ml×1. Conservazione a 4 ℃. Reagente IV:2.5 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente V: Polvere × 1. Conservazione a 4 ℃. Sciogliere con 2.5 mL di acqua distillata quando verrà utilizzata la soluzione, quindi diviso in pacchetti più piccoli, conservare a -20 ℃.

Reagente VI:12.5 μL×1. Conservazione a 4 ℃. Preparare il reagente VI e l'acqua distillata in base alla dimensione del campione nel rapporto di 1:20 (V: V) prima dell'uso.

Standard: Polvere 10 Mg × 1. Conservazione a 4 ℃.

Descrizione del prodotto

Glutatione ossidato(GSSG) è una forma ossidata di glutatione (GSH), Conosciuto anche come dioneglutatono, formato dall'ossidazione di due molecole di glutatione. GSSG è ridotto a GSH dalla glutatione reduttasi, Quindi la maggior parte del corpo è nella forma ridotta. La determinazione del contenuto di GSH e GSSG e il rapporto di GSH/GSSG nelle cellule possono riflettere lo stato redox delle cellule. Questo kit utilizza la reazione di glutatione e 5, 5′-acido ditiobis-2-nitrobenoico (Dtnb) per produrre 5-Thio-2- acido nitrobenzoico. 5-THIO-2- L'acido nitrobenzoico ha il più grande assorbimento alla lunghezza d'onda di 412 nm, e la 2-vinilpiridina inibisce la ridotta glutatione nell'originale dei campioni, e quindi usando il glutatione reduttasi per ridurre GSSG a GSH, determinare il contenuto di glutatione ossidato.

Specifiche tecniche

Limite di rilevamento minimo：3.211 μg/ml

Gamma lineare：3.9-125 μg/ml

Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti.

Equilibrio analitico, mortaio/omogeneizzatore, centrifuga refrigerata, bagnomaria, pipetta regolabile, Spettrofotometro/ lettore di micropiastre, microcuvetta in vetro/piastra a fondo piatto da 96 pozzetti.

Procedura

IO. Campione preparazione

1. 1. Campione di tessuto

Lavare i tessuti freschi con PBS per due volte, quindi aggiungi 0.1 g di campione nell'omogeneizzatore (L'omogeneizzatore è stato sciacquato con il reagente I e posto sul ghiaccio prima dell'uso). Aggiungere 1 ml di reagente I (La proporzione di tessuto e reagenti può essere mantenuta costante), macinazione completa su ghiaccio (L'uso dell'azoto liquido avrà un migliore effetto di macinazione). Centrifugare a 8000 × g e 4 ℃ per 10 minuti, Prendi il surnatante e mettilo a 4 ℃ per il test. (Il surnatante può essere conservato a -80 ℃ per 10 giorni.)

2. Campione di sangue

Plasma: Il campione è centrifugato a 600 × g e 4 ℃ per 10 minuti. Assorbendo il plasma superiore in un altro tubo aggiungi con lo stesso reagente di volume i. Centrifugare a 8000 × g e 4 ℃ per 10 minuti, Prendi il surnatante e mettilo a 4 ℃ per il test. (Il surnatante può essere conservato a -80 ℃ per 10 giorni.)

Cellule del sangue:Il campione è centrifugato a 600 × g e 4 ℃ per 10 minuti. Scartare il plasma superiore, Lavare con il volume degli alti di PBS per 3 volte (Mescolare le cellule del sangue con centrifuga PBS a 600 ×g per 10 minuti), Aggiungi uguale volume di reagente i. Dopo aver mescolato, è posizionato a 4 ℃ per 10 minuti. Centrifugare a 8000 ×g per 10 minuti, Prendi il surnatante e mettilo a 4 ℃ per il test. (Il surnatante può essere conservato a -80 ℃ per 10 giorni.)

3. Campione cellulare

La raccolta delle cellule non dovrebbe meno di 106, quindi lavarsi con PBS per due volte (Mescola la cella con centrifuga PBS a 600 × g per 10 minuti), mescolare la cella precipitata con il volume di PBS per 3 volte. Ripetuti congelamento e scongelamento 2-3 volte (suggerire congelati in azoto liquido, sciolto in 37 ℃ bagni d'acqua). Centrifugare a 8000 ×g per 10 minuti, Prendi il surnatante e mettilo a 4 ℃ per il test. (Il surnatante può essere conservato a -80 ℃ per 10 giorni.)

II. Procedura

1. Preriscaldare lo spettrofotometro/lettore di micropiastre per 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda su 412 nm, Imposta il contatore su zero con distillazione
2. Preriscaldare il reagente II nel bagno d'acqua per 30 minuti: 37℃ (cellula di mammifero) o 25 ℃ (altre specie).
3. La diluizione standard: Sciogliere lo standard con 1 mL di acqua distillata (4℃) a una concentrazione di 10 mg/ml. Prendi una soluzione adatta per preparare lo standard di concentrazione di 125 μg/ml、 5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml、7.8125μg/ml、3.90625μg/mland0μg/ml (Il diluente è un reagente diluito di dieci volte i).

4. Aggiungere 20 μl di standard o campione diluito a 0.5 Ml Centrifuge Tube, aggiungere 1 μL di Reagente II, incubare a 37 ℃ per 30 minuti dopo la miscelazione.
5. Crea curve standard

Dopo l'incubazione, aggiungere 140 μl di reagente III, 20 μL di Reagente IV, 20μl di reagente V, E 2 μl di reagente VI al tubo standard in sequenza. Dopo una rapida miscelazione, l'assorbimento della luce A1 e A2 di 30 sabbia 150 S rispettivamente sono stati misurati a 412 nm. Assorbanza (A2-A1) è l'ascissa (X) e la concentrazione è l'ordinata (y), Fare la curva standard.

Aggiungere 140 μl di reagente III, 20 μL di Reagente IV, 20 μl di reagente V, E 2 Reagente μlof VI ai tubi del campione in sequenza. Dopo una rapida miscelazione, l'assorbimento della luce A1 e A2 di 30 sabbia 150 S rispettivamente sono stati misurati a 412 nm, ΔA = A2- A1.

III. Calcoli

Secondo la curva standard, campione Δa nella formula (X), Calcola la concentrazione del campione di y

(μg/ml).

• Concentrazione proteica

GSSH (μg / Mg Prot)= y × vrv ÷ vrv ÷ cpr = y ÷ cpr

• Peso del campione

GSSH (μg /g)= y × vrv ÷(VRV ÷ vsv × w)= y ÷ w

• Cellmount

GSSH (μg /106 cella)= y × vrv ÷(VRV ÷ vsv × n)= y ÷ n

• Volume della soluzione

GSSH (μg / ml)= y × vrv/vs = 2y

N: Quantità di celle,106；

Corda: Volume totale di reazione, 0.203 ml；

Vsv: Il volume del surnatante è stato aggiunto nel sistema di reazione, 20 μl = 0,02 ml； W: Peso del campione, G;

Cpr: Concentrazione proteica nel surnatante, mg/ml.

Appunti:

1. Il campione deve essere completamente omogeneizzato. Se il test non può essere completato temporaneamente, Può essere conservato AT-80 ℃.
2. Se il contenuto del contenuto di GSSG nel campione è incerto, Diversi gradienti possono essere diluiti prima della misurazione.
3. Questo metodo utilizza la velocità di reazione enzimatica per calcolare la concentrazione del substrato e le letture complete nel modo più accurato possibile 30 E 150
4. Reagente I conteneva un precipitante proteico, Il surnatante non poteva essere usato per la determinazione della concentrazione di proteina. Se è necessario determinare il contenuto proteico, Prendi un altro tessuto.

Riferimento:

• Alpert a j, Gilbert H f. Rilevazione di glutatione ossidato e ridotto con una reazione postcolumn di riciclaggio[J]. Biochimica analitica, 1985, 144(2):553-562.
• Owens c w i, Belcher r un micro-metodo colorimetrico per la determinazione del glutatione[J]. Diario biochimico, 1965, 94(3): 705.

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