β-galattosidasi (β-gal) Kit di analisi
Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test.
Attrezzatura operativa: Microplate Reader/Spettrofotometro
Numero di catalogo: BC2585
Misurare:100T/48S
Componenti:
Estrarre la soluzione: Liquido 100 ml×1. Conservazione a 4 ℃.
Soluzione I.: Polvere×1. Conservazione a -20 ℃. Aggiungere 2.55 ml di acqua distillata in bottiglia prima dell'uso e dissolverla completamente. Il negozio di reagenti sinistro a -20 ℃.
Soluzione ⅱ: Liquido 4 ml×1. Conservazione a 4 ℃.
Soluzione ⅲ: Liquido 15 ml×1. Conservazione a 4 ℃.
Standard: Liquido 1 ml×1. Conservazione a 4 ℃. 5 Soluzione P-nitrofenolo μmol/mL.
Descrizione del prodotto
β-galattosidasi (β-gal, CE 3.2.1.23) è un enzima trovato ampiamente negli animali, impianti, microrganismi e cellule in coltura, che può catalizzare l'idrolisi dei legami β-galattosil e ha anche la funzione della transglicosilazione. β-gal può rilasciare energia immagazzinata per la rapida crescita delle piante, catalizza anche il degrado dei polisaccaridi, glicoproteine, e residui di galattosio terminale del galattosio nel normale metabolismo del polisaccaride, Metabolismo dei componenti della parete cellulare e durante l'invecchiamento della parete cellulare per rilasciare galattosio libero.
β-gal può catalizzare il fenil-β-piran galattoside a p-nitro fenolo. Il prodotto ha caratteristico dell'assorbimento a 400 nm. In questo kit, L'attività β-gal viene quantificata misurando l'aumento dello sviluppo del colore a 400 nm.
Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti.
Lettore di micropiastre o spettrofotometro, centrifuga, bagnomaria, pipetta di trasferimento, microcuvetta in vetro/piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, ghiaccio, mortaio/omogeneizzatore e acqua distillata.
Procedura
IO. Preparazione di campioni standard:
- Batteri o cellule
Raccolta di batteri o cellule nella provetta da centrifuga, dopo la centrifugazione scartare il surnatante. Suggerisci Aggiungi 1 ml di soluzione di estratto a 5 milioni di batteri o cellule. Usa l'ecografia per dividere i batteri e le cellule (posto sul ghiaccio, Potere ultrasonico 20%, ora di lavoro 3 secondi, intervallo 10 secondi, ripetere per 30 volte). Centrifuga a 15000 × g per 20 minuti a 4 ℃ per rimuovere i materiali insolubili e prendere il surnatante sul ghiaccio prima di testare.
- Tessuto
Aggiungere 1 ml di soluzione di estratto a 0.1 g di tessuto, e completamente omogeneizzato sul bagno di ghiaccio. Centrifuga a 15000 × g per 20 minuti a 4℃ per rimuovere materiali insolubili, e portare il surnatante sul ghiaccio prima del test.
II. Determinazione
- Preriscaldare il lettore di micropiastre o lo spettrofotometro per più di 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda su 400 nm, azzerare con acqua distillata.
- Standard diluire la soluzione a 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 nmol/ml con acqua distillata.
- Aggiungere i reagenti con il seguente elenco:
| Reagente | Provetta (T) | Tubo di contrasto (C) | Tubo standard (S) |
| Soluzione I. (μL) | 25 | – | – |
| Acqua distillata (μL) | – | 25 | – |
| Soluzione ⅱ (μL) | 35 | 35 | – |
| Campione (μL) | 10 | 10 | – |
| Mescolare accuratamente e incubare la reazione per 30 minuti a 37 ℃ bagni d'acqua. | |||
| Standard (μL) | – | – | 70 |
| Soluzione ⅲ (μL) | 130 | 130 | 130 |
Mescolare accuratamente. Rilevare l'assorbanza di ciascun tubo a 400 nm e noto come a, AC, Come e ab. Calcolare
ΔAT = AT – AC, ΔAS = AS – AB. Ogni tubo di prova dovrebbe essere fornito con un tubo di contrasto.
III. Calcolare:
1. Curva standard
Curva standard stabilita: Secondo la concentrazione del tubo standard (y nmol/ml) e assorbanza ΔAS = AS – AB (X), stabilire la curva standard. Aggiungi ΔA nella curva standard, e calcola la quantità di prodotto generato dal campione (nmol/mL).
2. Calcolo
- Concentrazione proteica tissutale
Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzimi catalizza la generazione di 1 nmol di p-nitrofenolo nel sistema di reazione all'ora, ogni mg di proteine.
Attività β-gal(U/mg prot)=(y × vrv)÷(Vs×Cpr)÷ t = 14 × y ÷ cpr
- Peso del tessuto
Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzimi catalizza la generazione di 1 nmol di p-nitrofenolo nel sistema di reazione all'ora, ogni g di campione.
Attività β-gal(U/g )= (y × vrv)÷(W × vs ÷ ve)÷ t = 14 × y ÷ w
- Batteri o cellule coltivate
Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzimi catalizza la generazione di 1 nmol di p-nitrofenolo nel sistema di reazione all'ora, ogni 104 batteri o cellule.
Attività β-gal(Cella U/104)=(y × vrv)÷(500×Vs÷Ve)÷ t = 0,028 × y
Cpr: Concentrazione di proteina del campione di surnatante (mg/ml); Corda: Volume totale di reazione, 0.07 ml;
Contro: Volume supernato, 0.01 ml; Ve: Estrarre il volume della soluzione,1 ml;
T: Tempo di reazione (min), 30 minuti = 0.5 ora; W: Peso del campione, G;
500: 5 milioni di cellule o batteri.
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