1. Componenti del kit di reagenti
| Specifiche | 50T | 100T |
| Gatto. NO. | SN0237 | SN0238 |
| Colonne di estrazione del DNA (impostato) | 50 (impostato) | 100 (impostato) |
| Reagent Buffer E1 | 50ml | 2x50ml |
| Reagent Buffer E2 | 30ml | 2x30ml |
| Tampone reagente B | 20ml | 2x20ml |
| Tampone reagente C | 30 ml | 30 ml |
| Tampone di lavaggio 1 | 15 ml | 2 × 15 ml |
| Tampone di eluizione | 20 ml | 20 ml |
| Proteinasi K | 1ml | 1ml |
| RNasi A | 1ml | 1ml |
| Manuale di istruzioni | 1 | 1 |
2. Magazzinaggio
This kit can be stored at room temperature (15-25℃) in dry conditions for 12 mesi. The DNA extraction purification columns can be stored in a cool and dry environment for 1 anno. Proteinasi K e RNasi A contengono conservanti, consentendo il trasporto a temperatura ambiente, ma per la conservazione a lungo termine, dovrebbero essere mantenuti a -20 ℃. Reagent buffers E1/E2 should be stored at 4℃.
3. Istruzioni per l'uso del kit di reagenti
3.1 Questo kit di reagenti è destinato alla ricerca di biologia molecolare e non deve essere utilizzato per la diagnosi o il trattamento di malattie.
3.2 Alcuni componenti del kit di reagenti contengono sostanze irritanti. Si raccomandano misure protettive come indossare indumenti protettivi e occhiali protettivi.
3.3 Durante l'utilizzo di questo kit di reagenti, una centrifuga ad alta velocità, bagnomaria (bagno di metallo), miscelatore a vortice, etanolo anidro, PBS,acqua deionizzata sterile, e le provette EP devono essere preparate dall'utente.
4. Introduzione al kit di reagenti
The Mitochondrial Genome Purificazione del DNA Kit offers a rapid and efficient method for purifying DNA from animal tissues and cell cultures. Widely used in both animal tissue and cell cultures, this kit consists of two parts. The first part involves rapid collection of high-purity animal tissue and cell mitochondria using gradient centrifugation. The second part utilizes a column-based method for quick extraction of mitochondrial DNA without the need for toxic reagents like phenol-chloroform. Il DNA estratto può essere utilizzato direttamente per PCR, Southernblotting, e altre applicazioni.
5. Principi e procedure sperimentali
6. Processo di estrazione
Prima di iniziare l'esperimento:
UN. Reagent Buffers B and C tend to precipitate under low-temperature conditions. Si consiglia di riscaldarli a 65 ° C per 5 minutes until the precipitates dissolve before normal use.
B. Prima di usare Tampone di lavaggio 1, follow the instructions on the reagent bottle label to add the specified amount of absolute ethanol. Poi, check the label to indicate that ethanol has been added.
C. Il tampone di eluizione è un 0.1x soluzione TE with minimal EDTA content. Se l'EDTA influisce sugli esperimenti successivi, it is suggested to use sterile deionized water instead of the elution buffer.
D. Mitochondrial Collection: The first part involves collecting mitochondria, where centrifugation is crucial. During the extraction process, centrifugal force is expressed in ‘g’. Most centrifuges have a rpm/g conversion mode, so please pay attention.
- Elaborazione del campione:
UN. Take cell culture medium, centrifuge at 1000g for 1 minute to collect cells. Try to remove as much supernatant as possible. Aggiungere 1ml PBS (PH7.9) to wash the cells, centrifuge to collect them, quindi aggiungi 1ml pre-cooled (0℃) Reagent Buffer E1 to fully suspend the cells and homogenize rapidly 5-10 volte.
B. Cut tissues not exceeding 200 mg into small pieces, aggiungere 1ml PBS (PH7.9) for washing and absorb excess liquid with filter paper. Aggiungere 1ml pre-cooled (0℃) Reagent Buffer E1 and grind in an ice bath about 20 volte.
2. Transfer the liquid mixture to a centrifuge tube, centrifugare a 4℃, 1000g per 5 minuti, and transfer the supernatant to a new centrifuge tube.
(Nota: There may be precipitates in this transferred supernatant. For obtaining high-purity mitochondria, it is recommended to centrifuge and transfer the supernatant during step 2.)
- Transfer the supernatant obtained in the previous step to a new centrifuge tube, centrifuge at 12000g, 4℃ per 10 minuti, and discard the supernatant.
(Nota: After this step, mitochondria will precipitate at the bottom of the tube.)
- Recommended step: Aggiungere 5ml Reagent Buffer E2 to the mitochondrial pellet, resuspend it, centrifugare a 4℃, 1000g per 5 minuti, Trasferisci il surnatante in una nuova tuba di centrifuga, then centrifuge at 12000g, 4℃ per 10 minuti, scartare il surnatante, and obtain high-purity mitochondrial precipitates at the tube bottom.
(Nota: Mitochondria collection at this step is complete. You may interrupt the experiment and store mitochondria at -70℃.)
Second Part: Isolation and Purification of Mitochondrial DNA
- Aggiungere 280μl of Reagent Buffer B, 10µl di RNasi A, and 10μl of Proteinase K to the centrifuge tube containing mitochondria. Thoroughly invert to mix, digest at 65℃ per 5 minuti.
- Aggiungere 300μl of Reagent Buffer C to the lysate and mix well. If a white precipitate appears, it can be left undisturbed; its disappearance will not affect subsequent experiments.
- Aggiungere 300μl of absolute ethanol e mescolare accuratamente. It may cause precipitation, Ma non influirà sugli esperimenti successivi.
- Transfer the obtained liquid to the DNA extraction purification column (impostato) (circa 650~700μl ogni volta). Centrifuge at more than 8,000 giri al minuto per 1 minuto, scartare i rifiuti raccolti, e reinserire il tubo di raccolta nella colonna di purificazione per il passaggio successivo.
- Posizionare la colonna di purificazione per l'estrazione del DNA (impostato) in un tubo di raccolta, aggiungere 300ml di tampone di lavaggio 1, centrifuge at more than 8,000 giri al minuto per 1 minuto, scartare i rifiuti, e reinserire la colonna di purificazione per l'estrazione del DNA (impostato) nel tubo per il passaggio successivo.
(Nota: Confirm that absolute ethanol has been added to Wash Buffer 1.)
- Aggiungere 400ml di tampone di lavaggio 1 alla colonna di purificazione per l'estrazione del DNA (impostato), centrifugare a 14,000 giri/min (20,000× g) per 2 minuti. Extend centrifugation time appropriately for a drier membrane.
- Posizionare la colonna di purificazione per l'estrazione del DNA (impostato) in a new centrifuge tube, open the cap, and incubate at 65℃ per 2 minuti. Extend this step as needed to evaporate ethanol completely to prevent residual ethanol from affecting downstream experiments.
- Drip-suspend 50-100μl di tampone di eluizione sulla membrana, centrifugare a 12,000 giri al minuto per 2 minuti.
(Nota: 1. Eluting DNA with 50μl of Elution Buffer can increase DNA concentration but reduce the total yield; 2. The eluted DNA wash can be reapplied to the DNA extraction purification column for an additional collection at 12,000 giri al minuto per 2 minutes to increase DNA yield.)
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