Kit per il rilevamento della mutazione del gene EGFR umano (Metodo PCR-fluorescenza) 12T Per la ricerca

Descrizione del prodotto:

• Nome: Kit di rilevamento della mutazione del gene EGFR
• Scopo: Rilevamento qualitativo di 11 mutazioni comuni nel gene EGFR umano.
• Esemplari: Esemplari di DNA da sezioni incorporate in paraffina di pazienti con diagnosi clinicamente con carcinoma polmonare non a piccole cellule.
• Verifica: Il prodotto è stato verificato per le prestazioni di rilevamento delle mutazioni del gene target ma non è stato combinato con farmaci specifici negli studi clinici.

Uso e limitazioni:

• Utilizzo: I risultati del rilevamento possono aiutare nello screening di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule adatte per terapia mirata all'EGFR.
• Limitazioni: I risultati del rilevamento da soli non possono essere usati come unica base per la diagnosi clinica.

Informazioni di base:

• Egfr: Recettore del fattore di crescita epidermico, una proteina di membrana cruciale per la proliferazione cellulare, crescita, riparazione, e sopravvivenza alle cellule tumorali.
• Struttura genica: Situato sul cromosoma 7 (7P12 ~ 14), Il gene EGFR comprende 28 esoni. Esoni 18-24 formare il dominio della tirosina chinasi che codifica il gene.
• Attenzione della mutazione: La maggior parte delle mutazioni si verificano negli esoni 18-21, in particolare esone 19 delezione ed esone 21 Mutazione L858R.
• Rilevanza clinica: Queste mutazioni prevedono l'efficacia dei farmaci mirati nel trattamento del carcinoma polmonare non a piccole cellule e guidare la selezione dei farmaci per il trattamento del tumore.
• Requisito FDA: Il rilevamento della mutazione del gene EGFR è obbligatorio per i pazienti che considerano il trattamento EGFR-TKI.

Tavolo 1: Mutazioni comuni del gene EGFR

Mutazione	Esone	Cambiamenti della sequenza di aminoacidi	Cambiamenti della sequenza di base	ID cosmico
Ex 18-MU-1	18	G719S	2155G>UN	6252
Ex 18-Mu-2	18	G719C	2155G>T	6253
Ex 18-MU-3	18	G719A	2156G>C	6239
Ex 19-Mu-1	19	Glu746-AA750del	2235-2249del	6223
Ex 20-Mu-1	20	S768i	2303G>T	6241
Ex 20-Mu-2	20	T790M	2369C>T	6240
Ex 20-MU-3	20	V769-D770insasv	2307_2308insgccagcgtg	12376
Ex 20-MU-4	20	H773-V774insh	2319_2320inscac	12377
Ex 20-MU-5	20	D770-N771insg	2310_2311insggt	12378
Ex 21-Mu-1	21	L858	2573T>G	6224
Ex 21-Mu-2	21	L861Q	2582T>UN	6213

Principio della prova

Questo kit è progettato per rilevare mutazioni specifiche nel gene EGFR. Include primer e sonde per il rilevamento:

1. Mutazioni G719x (G719S, G719C, G719A) nell'esone 18,
2. Mutazioni di cancellazione dell'esone 19 (tra cui 2235-2249del 15),
3. Mutazioni S768i e T790M nell'esone 20,
4. Tre tipi di mutazioni di inserimento (2307_2308insgccagcgtg, 2319_2320inscac, e 2310_2311insggt),
5. Mutazioni L858R e L861Q nell'esone 21.

Durante il rilevamento delle mutazioni, Se il campione contiene modelli di DNA mutazionale:

• I primer e le sonde specifici della mutazione rilevata si legaranno al DNA del modello.
• PCR si verificherà l'amplificazione, Rilascio di segnali di fluorescenza.
• Il monitoraggio in tempo reale e l'uscita della potenza del segnale di fluorescenza saranno condotti utilizzando un amplificatore PCR quantitativo fluorescente.

Se il campione non contiene modelli di DNA mutazionale:

• I primer e le sonde specifici della mutazione non si legaranno al DNA del modello, o il loro vincolo verrà bloccato.
• Ciò non comporterà l'amplificazione della PCR o l'amplificazione PCR inibita.
• Di conseguenza, Non verranno rilasciati segnali di fluorescenza.

Complessivamente, Il kit consente l'analisi qualitativa dei risultati del rilevamento attraverso il monitoraggio in tempo reale dei segnali di fluorescenza durante l'amplificazione della PCR.

Tavolo 2 Ingredienti principali del kit

Tubo n.	Nome dell'etichetta	Ingredienti principali	Specifiche di imballaggio (12 Test/kit)	Specifiche di imballaggio (24 Test/kit)
1	Liquido di reazione PCR G719x	Tampone PCR, dntps, Primer e sonda G719x	1 tubo (290µl)	1 tubo (580µl)
2	Liquido di reazione PCR S768i	Tampone PCR, dntps, S768I Primer e sonda	1 tubo (290µl)	1 tubo (580µl)
3	Liquido di reazione PCR T790M	Tampone PCR, dntps, Primer e sonda T790M	1 tubo (290µl)	1 tubo (580µl)
4	Liquido di reazione PCR L858R	Tampone PCR, dntps, L858R Primer e sonda	1 tubo (290µl)	1 tubo (580µl)
5	Liquido di reazione PCR L861Q	Tampone PCR, dntps, Primer e sonda L861Q	1 tubo (290µl)	1 tubo (580µl)
6	INS PCR Reaction Liquid	Tampone PCR, dntps, INS Primer e Sonda	1 tubo (290µl)	1 tubo (580µl)
7	Liquido di reazione del PCR	Tampone PCR, dntps, Del primo e della sonda	1 tubo (290µl)	1 tubo (580µl)
8	Liquido di reazione PCR di controllo della qualità	Tampone PCR, dntps, Primer e sonda di controllo di qualità	1 tubo (290µl)	1 tubo (580µl)
9	Miscela enzimatica	Miscela enzimatica contenente enzima taq e enzima UNG	1 tubo (24µl)	1 tubo (48µl)
10	Colorante di riferimento	Dye Rox	1 tubo (45µl)	1 tubo (90µl)
11	Modello standard interno	Modello di DNA standard interno	1 tubo (100µl)	1 tubo (100µl)
12	Controllo debolmente positivo	Contenente modello DNA di mutazione	1 tubo (200µl)	1 tubo (200µl)
13	Controllo vuoto	Tris-HCl respingente (10mm)	1 tubo (200µl)	1 tubo (200µl)

Condizioni di stoccaggio e durata di conservazione:

1. La durata del kit è 9 mesi se conservati a -20 ℃ ± 5 ℃ e protetti dalla luce.
2. Ridurre al minimo il congelamento e lo scongelamento a meno di 6 volte durante l'uso.
3. La data di produzione e la data di scadenza sono indicate sull'etichetta.

Strumenti applicabili:

1. Il kit è compatibile con Stratagene MX3000P, AB 7500, e lightcycler 480 amplificatori PCR quantitativi fluorescenti in tempo reale.
2. Usa il canale FAM per raccogliere segnali fluorescenti dell'amplificazione del gene EGFR, Canale VIC/Joe/Hex per segnali di amplificazione genica standard interni, e impostare il segnale di riferimento (Rox).

Requisiti del campione:

1. Il DNA di alta qualità è cruciale. Il kit è adatto per rilevare il DNA del genoma umano estratto da tessuti patologici incorporati in paraffina confermati da un medico per contenere tessuti tumorali. Esemplari all'interno 3 sono suggeriti anni.
2. Kit di estrazione del DNA Qiagen (Qiaamp DNA Ffpe Kit di tessuto, Gatto n. 56404) è raccomandato. La concentrazione e la purezza del DNA estratte devono essere testate con uno spettrofotometro UV (OD260/OD280: 1.8-2.0). Diluire il DNA a 10-15ng/μl e testare immediatamente o memorizzare sotto -20 ℃ senza congelamento ripetitivo e scongelamento.

Metodi di prova:

1. Preparazione del reagente:

1. Consenti al kit di raggiungere la temperatura ambiente, Sciogli completamente tutti i componenti, e centrifuga per 10 secondi.
2. Determina il numero di reazioni (N) necessario. Preparare 7 Tipi di miscele di reazione PCR di mutazione e miscele di reazione PCR di controllo della qualità secondo il metodo specificato nella tabella 3.
3. $N=\text{Numero di esemplari}+\text{Controllo vuoto (1T)}+\text{Controllo debolmente positivo (1T)}$
4. Imballa il tubo preparato 1-8 Liquido di reazione della PCR in tubi di reazione in base alla quantità di imballaggio di 23 μl per pozzetto.
5. Trasferisci i tubi di reazione PCR nell'area di preparazione del campione. Conservare il reagente rimanente di nuovo in frigorifero a -20 ℃ ± 5 ℃ per congelamento e protezione dalla luce.

Tavolo 3: Metodo di preparazione di ciascun sistema di reazione PCR

Componente	Formula del sistema di reazione singola	Formula di n sistemi di reazione
Liquido di reazione PCR	22.3μL	22.3× n μl
Miscela enzimatica	0.2μL	0.2× n μl
Colorante di riferimento (Rox)	0.4μL	0.4× n μl
Modello standard interno	0.1μL	0.1× n μl

2. Preparazione del campione:

(Area di preparazione del campione)

1. Estrazione del DNA del campione:
   • Seguire le istruzioni fornite con il kit di estrazione del genoma commerciale acquistato.
2. Aggiunta del campione:
   • UN) Aggiungi DNA del genoma, controllo debolmente positivo, e controllo in bianco dei campioni da testare nei tubi di reazione contenenti il 1-8 Miscela di reazione PCR. Ogni campione viene testato con 8 Tipi di miscela di reazione PCR, con una quantità aggiuntiva di 2μl per pozzetto. La concentrazione raccomandata di DNA del campione è 10-15ng/μl.
   • B) Se i tubi di reazione PCR con modelli aggiunti non possono essere immediatamente posizionati sullo strumento a causa di situazioni temporanee, Conservali temporaneamente 2-8 ℃ e condurre il rilevamento sullo strumento il più presto possibile 24 ore.

3. Amplificazione PCR:

(Area di amplificazione dell'acido nucleico)

1. Avviare lo strumento ed eseguire l'auto-ispezione delle prestazioni dello strumento.
2. Prendi i tubi di reazione PCR preparati nell'area di preparazione del campione e posizionarli in posizioni corrispondenti nel serbatoio del campione dello strumento. Registra la sequenza di posizionamento.
3. Imposta parametri rilevanti per l'amplificazione dell'acido nucleico secondo la tabella 4 e inizia l'amplificazione PCR. Dopo il completamento della reazione, Definire una soglia di fluorescenza appropriata (generalmente delimitato nel mezzo della fase di crescita esponenziale sotto la forma logaritmica della curva di amplificazione) Per ottenere valori CT per canali diversi e calcolare i valori △ CT rilevanti in base alla curva di amplificazione.

Tavolo 4: Parametri rilevanti dell'amplificazione dell'acido nucleico dello strumento

Condizioni di reazione PCR	Fase	Condizioni	Numero di cicli
Trattamento UNG	37℃	10 minuti (min)	1
Pre-degenerazione	95℃	5 minuti (min)	1
PCR	95℃	15 secondi (S)	40
	60℃	60 secondi (S)
		(Segnali di fluorescenza raccolti alla fine di questa fase)

Acquisizione del segnale:

• Gene EGFR: I segnali di fluorescenza vengono raccolti dal canale FAM.
• Gene standard interno: I segnali di fluorescenza vengono raccolti dal canale esadecimale/vic/joe.

Analisi dei risultati:

Dopo il completamento della reazione, La soglia è impostata in base alla curva di amplificazione per calcolare △ CT (△ ct = rilevamento mutazione ct – CT di rilevamento del controllo di qualità) e interpreta i risultati.

Interpretazione dei risultati dei test:

1. Determinazione dell'efficacia del kit:

1. Controllo debolmente positivo:
   • Il valore CT del canale FAM è ≤32 con un'ovvia fase di crescita esponenziale nella curva di amplificazione.
2. Controllo vuoto:
   • Fam Channel non mostra una curva di amplificazione o una linea retta o una leggera linea obliqua. Nessuna ovvia fase di crescita esponenziale, Il valore CT è ≥38.
3. Gene standard interno:
   • Nel controllo vuoto, Il valore CT del canale esadecimale/vic/joe è <38 con un'ovvia fase di crescita esponenziale.
   • Nel campione testato e nel tubo di reazione debolmente positivo, Assenza occasionale di segnale nel canale esadecimale/vic/joe quando il canale FAM ha un segnale a causa dell'inibizione di amplificazione standard interna da parte dell'amplificazione del gene target.

2. Determinazione dell'efficacia del campione:

1. Liquido di reazione PCR di controllo della qualità:
   • Per Fam Channel, Ct < 23, indicando il sovradosaggio del DNA del genoma del campione. RIPOSSATO DI RIPUGGIO DOPO DOPO DILUZIONE.
2. Liquido di reazione PCR di controllo della qualità:
   • Per Fam Channel, 23 ≤ ct ≤ 30, indicando una dose moderata di DNA del genoma del campione.
3. Liquido di reazione PCR di controllo della qualità:
   • Per Fam Channel, 30 < Ct < 34, indicando una dose più bassa di DNA del genoma del campione. Il tipo di mutazione può essere testato solo in campioni con un maggiore contenuto di DNA di mutazione.
4. Liquido di reazione PCR di controllo della qualità:
   • Per Fam Channel, CT ≥ 34, indicando una dose di aggiunta troppo bassa di DNA del genoma del campione. Richiede la preparazione di nuovi campioni o l'aggiunta dell'importo dell'utilizzo per il rilevamento.

3. Determinazione dei risultati di rilevamento:

Dopo aver determinato l'efficacia del rilevamento, Calcola il valore △ CT dei campioni di rilevamento effettivi e determina i risultati di rilevamento in base ai seguenti passaggi e tabella 5 Per confermare la presenza di mutazione nel campione.

1. Nel rilevamento delle mutazioni del campione, Valore CT > 36 indica che il campione è negativo o inferiore al limite di rilevamento inferiore di questo kit.
2. Nel rilevamento delle mutazioni del campione, Se il valore CT è ≤ 36, Calcola il valore △ CT di questo tubo di reazione. Se il valore △ CT è inferiore al corrispondente valore di cut-off △ CT, Il campione è considerato positivo alla mutazione. Altrimenti, è considerata mutazione negativa o inferiore al limite di rilevamento inferiore di questo kit.
3. Applicazione dei criteri di determinazione di cui sopra, Il tipo di mutazione del campione positivo G719X può essere uno dei G719, G719C, e G719a. Il tipo di mutazione del campione positivo INS può essere uno di V769-D770InsASV, H773-V774insh, e D770-N771insg. Questo prodotto non può essere ulteriormente diviso.

Tavolo 5: Determinazione dei risultati

Liquido di reazione	Tipo di mutazione	Negativo	Positivo
Liquido di reazione PCR G719x	G719X	Ct > 36 o nessun valore CT	CT ≤ 36, ΔCT ≥ 7
Liquido di reazione PCR S768i	S768i	Ct > 36 o nessun valore CT	CT ≤ 36, ΔCT ≥ 7
Liquido di reazione PCR T790M	T790M	Ct > 36 o nessun valore CT	CT ≤ 36, ΔCT ≥ 7
Liquido di reazione PCR L858R	L858	Ct > 36 o nessun valore CT	CT ≤ 36, ΔCT ≥ 7
Liquido di reazione PCR L861Q	L861Q	Ct > 36 o nessun valore CT	CT ≤ 36, ΔCT ≥ 7
INS PCR Reaction Liquid	Ins	Ct > 36 o nessun valore CT	CT ≤ 36, ΔCT ≥ 6
Liquido di reazione del PCR	Del	Ct > 36 o nessun valore CT	CT ≤ 36, ΔCT ≥ 6

Limitazioni dei metodi di prova:

1. L'accuratezza dei risultati del rilevamento dei campioni dipende dalla qualità della raccolta dei campioni, trattamento, e spazio di archiviazione. Gli errori in questi processi possono portare a risultati di rilevamento inaccurati. Scarsa qualità del DNA durante il trattamento del campione può provocare risultati falsi negativi. Per il canale FAM del liquido di reazione PCR di controllo di qualità, campioni con valori CT tra 23 E 30 Indicare una qualità del DNA relativamente buona e un'aggiunta di campione moderata, con conseguenti risultati di rilevamento più accurati.
2. I risultati negativi ottenuti dal rilevamento dei campioni non possono escludere la presenza di mutazioni con bassa abbondanza o mutazioni in altri loci del gene EGFR.
3. I risultati di rilevamento di questo kit sono destinati al riferimento clinico per guidare la medicina personalizzata e non devono essere utilizzati come unica base per la diagnosi clinica.

Indici di prestazione del prodotto:

1. Il kit è completamente imballato senza trabocco di contenuti. L'etichetta è intatta con un chiaro contenuto di identificazione. La composizione del kit è corretta senza ripetizione o componenti mancanti.
2. Viene rilevato un riferimento specifico utilizzando il 7 Tipi di liquido di reazione di mutazione incluso nel kit, e tutti i risultati di rilevamento sono negativi.
3. La sensibilità delle mutazioni corrispondenti viene rilevata usando il 7 Tipi di liquido di reazione di mutazione incluso nel kit, E tutti i risultati di rilevamento sono positivi.
4. Il limite più basso di rilevamento può raggiungere 1%, consentendo il rilevamento di vari tipi di mutazioni del gene EGFR nel DNA del genoma a 20ng.
5. Il kit viene utilizzato per rilevare ripetutamente il riferimento di precisione del gene EGFR 10 volte, con un coefficiente di variazione intra-dosaggio (Cv) di ≤5%.

Precauzioni:

1. Questo kit è destinato solo alla diagnosi in vitro.
2. Non mescolare i reagenti da questo kit con quelli di altri lotti.
3. Il controllo debolmente positivo in questo kit non è contagioso ma dovrebbe essere gestito come materiale potenzialmente infettivo.
4. I reagenti residui nel kit e nei rifiuti dell'esperimento devono essere gestiti secondo le linee guida per lo smaltimento dei rifiuti medici.

Riferimenti:

1. Linee guida per la pratica clinica NCCN in oncologia – Linea guida per il cancro del polmone non a piccole cellule (Edizione cinese), V1.2009.
2. Huang Jie, Qu Shoufang, et al. Istituzione di materiali di controllo della mutazione del gene EGFR umano. Giornale cinese dell'analisi farmaceutica, 2011, 31(9):1758-1763.
3. Consenso esperto sulla rilevazione della mutazione genica del recettore del fattore di crescita epidermico di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule in Cina. Journal of Pathology cinese, 2011, 40(10).