Nitrat Reduktase (tidak) Kit Pengujian（Metode Griess-Kolorimetri）

Ikhtisar Produk

tidak (EC 1.7.1.3) merupakan enzim yang banyak ditemukan pada tumbuhan. Ini memainkan peran penting dalam mengubah nitrogen nitrat menjadi nitrogen amonia dan juga merupakan enzim yang dapat diinduksi, mempengaruhi hasil dan kualitas tanaman. NR mengkatalisis reduksi nitrat menjadi nitrit: NO3- + NADH+H+ → NO2- + NAD+ + H2O. Dalam kondisi asam, NO2 yang dihasilkan- dapat berpartisipasi dalam reaksi diazotisasi untuk membentuk senyawa berwarna magenta. Senyawa ini mempunyai puncak serapan pada 540 nm, dan perubahan serapan pada 540 nm dapat digunakan untuk mewakili aktivitas enzim.

Komponen Perangkat

• Solusi Stok Induser: 50 ml x 1 botol
• Solusi Ekstraksi: 30 ml x 1 botol
• Reagen Satu: 12 ml x 1 botol
• Reagen Dua: Bedak x 2 botol
• Reagen Tiga: 15 ml x 1 botol
• Reagen Empat: 15 ml x 1 botol
• Standar: 1 ml x 1 botol kecil

Persiapan Solusi

1. Solusi Induser: Encerkan larutan stok induser 10 kali lipat dengan air suling sebelum digunakan. Mengambil 10 mL larutan stok induser dan tambahkan 90 mL air suling. Aduk rata. Siapkan segar sebelum digunakan.
2. Reagen Dua: Menambahkan 1 mL air suling. Aliquot dan simpan pada suhu -20°C. Itu bisa disimpan untuk 2 minggu pada suhu -20°C. Sebelum digunakan, encerkan Reagen Dua 50 kali lipat dengan air suling. Mengambil 10 μL Reagen Dua dan tambahkan 490 μL air suling. Aduk rata.
3. Standar: Mempersiapkan a 0.1 μmol/mL larutan standar natrium nitrit dengan mengencerkan 10 μmol/mL larutan standar natrium nitrit 100 kali lipat dengan air suling sebelum digunakan.

Catatan

1. Jika serapannya lebih besar dari 0.8, encerkan sampel dengan larutan ekstraksi. Perhatikan penyesuaian faktor pengenceran sesuai rumus perhitungan.
2. Ikuti dengan ketat urutan penambahan reagen yang tercantum dalam tabel pengujian sampel untuk percobaan.

Prosedur Eksperimental

SAYA. Perawatan Sampel

1. Pra-perawatan Jaringan:

   • Tambahkan larutan induser secukupnya ke dalam gelas kimia. Cuci sampel segar, keringkan dengan kertas saring, dan masukkan ke dalam larutan induser (cukup untuk tenggelam). Inkubasi dalam gelap untuk 2 jam. Hapus sampel, keringkan dengan kertas saring, dan bekukan pada suhu -20°C selama 30 menit. Cairkan sampel dan keringkan kembali dengan kertas saring. (Lakukan perawatan induksi sesuai kebutuhan. Umumnya, pengobatan induksi tidak diperlukan. Jika hasil pra percobaan menunjukkan tidak ada aktivitas, pengobatan induksi diperlukan.)
   • Timbang kira-kira 0.1 g sampel dan tambahkan 1 mL larutan ekstraksi sesuai dengan perbandingan berat jaringan (G) terhadap volume larutan ekstraksi (ml) dari 1:5 ke 10. Giling dalam penangas es, sentrifugasi di 8000 G, 4°C untuk 10 menit, dan kumpulkan supernatannya. Simpan supernatan di dalam es untuk pengujian.

2. Pra-perawatan Sel atau Bakteri:

   • Kumpulkan sampel sel atau bakteri dalam tabung sentrifugasi dan buang supernatannya. Menambahkan 1 mL larutan ekstraksi per 5 juta sel atau bakteri. Sonikasikan bakteri atau sel (kekuatan 200 W, sonikasi 3 detik, selang 10 detik, mengulang 30 waktu). Sentrifugasi di 8000 G, 4°C untuk 10 menit, kumpulkan supernatan dan simpan di es untuk pengujian.

II. Langkah-Langkah Pengujian

1. Panaskan terlebih dahulu spektrofotometer tampak sekurang-kurangnya 30 menit, sesuaikan panjang gelombangnya 540 nm, dan nol dengan air suling.
2. Uji Sampel: