Komponente:

Otopina ekstrakta: 80ml × 1. Skladištenje na 4 ℃.

Reagens 1: 40ml × 1. Skladištenje na 4 ℃.

Reagens 2: Prah × 1. Skladištenje na -20 ℃, otopi se s 1 ml acetona. Otopljeni reagens 2 može se pohraniti na -20 ℃ nakon izdavanja. Razrijediti 100 puta kada se koriste.

Reagens 3: Prah × 1. Skladištenje na 4 ℃, Otopite se s 3 ml acetona prije upotrebe. Reagens 4: 5ml × 1. Skladištenje na 4 ℃.

Opis proizvoda:

Mitohondrijski kompleks II isti je kao sukcinata-co-enzim q reduktaza, koji široko postoji u mitohondrijama životinje, biljka, mikroorganizmi i kultivirane stanice. Katalizira sukcinsku kiselinu da nastavi fumaričnu kiselinu, Smanjite FAD na formiranje FADH2. FADH2 smanjuje oksidirani COQ da tvori smanjeni COQ, koja je grana lanca respiratornog transporta elektrona.

CoQ da katalitički proizvod kompleksa II može smanjiti 2,6-dikloroindofenol, koji ima apsorbanciju na 605 NM, Aktivnost enzima može se izračunati otkrivanjem stope smanjenja 2, 6-diklorindolefeno.

Potrebni reagensi i oprema, ali nisu pruženi:

Spektrofotometar, vodena kupelji, stolna centrifuga, PRIJENOS, 1ML staklena kiveta, minobacač/ homogenizator, aceton, led i destilirana voda.

1. Kompleks II izvlačenje:

• Prikupljanje 0,1 g tkiva ili 5 milijun stanica, Dodajte 1 ml otopinu ekstrakta i mljejte na ledu maltera/homogenizatora;
• centrifugirati na 600 g i 4 ℃ za 10 min. Odbacite talog i prebacite supernatanta u drugu cijev, centrifuga na, 11000g i 4 ℃ za 15 min;
• Supernatant, Tj., citoplazmatski ekstrakt, može se koristiti za određivanje kompleksa II koji curi iz mitohondrija, Ovaj korak može pokazati učinak ekstrakcije mitohondrija;
• Dodati 400 Otopina ekstrakcije μl na sediment, razdvajanje s ultrazvukom (vlast 20%, Radno vrijeme 5s, Interval 10s, ponoviti 15 vrijeme), koristi se za otkrivanje kompleksne ⅱ aktivnosti i sadržaja proteina.

Određivanje koraka

1. Predgrijan spektrofotometar za 30 min, Podesite valnu duljinu na 605 NM, Postavite brojač na nulu s destiliranim
2. Određivanje uzorka

• Izrada radnog rješenja: Pomiješajte reagens 2 i reagens 3 prema 1:1 Prije upotrebe. Pripremite se kada se koristi. Pripremljeno kada će se otopina koristiti.
• Zagrijte reagens1 na 37 ℃ (ćelija sisavaca) ili 25 ℃(Ostale vrste) za 15
• Dodajte sljedeće reagense u 1 ml staklenoj kiveti:

Izračunavanje:

Definicija jedinice: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira konzumaciju 1nmol od 2, 6-diklorindolepheno po mg proteina tkiva u svakoj minuti.

Složena ⅱ aktivnost (U/Mg Prot)= =[ΔA × vrv ÷(ε × D)× 109]÷(VS × CPR)÷ t = 476,2 × ΔA ÷ CPR

e.: 2, 6-koeficijent molarnog izumiranja diklorindolepheno, 2.1× 104L/mol/cm; d: Lagani put kivete, 1 cm;

Vrpca: Ukupni volumen reakcije,1ml; Vs: volumen uzorka (ml), 0.05 ml;

CPR: Koncentracija proteina uzorka (mg/ml); T: vrijeme reakcije (min), 2 min;

Bilješka:

1. Uzmite dva ili tri različita uzorka za predviđanje prije ispitivanja kako biste osigurali točnost eksperimentalnih rezultata. Razrijedite supernatant destiliranom vodom ako je apsorbancija veća od 1.5. Razrijedite uzorak s destiliranom vodom ako je ΔA>0.4, Pomnožite razrijeđene vrijeme u formuli. Povećati volumen uzorka ako je ΔA spor.
2. Otkrijte koncentrat proteina uzorka sami, Možete koristiti Solarbio (PC0020 BCA protein Komplet za analizu). Budući da je protein sadržan u ekstraktu, Sadržaj proteina u samom ekstraktu treba oduzeti prilikom određivanja koncentracije proteina u uzorku.
3. Preporučuje se korištenje koncentracije proteina uzorka za izračunavanje aktivnosti enzima. Ako se uzorak svježe težine koristi za izračunavanje, Potrebno je izmjeriti aktivnost enzima citoplazmatskog ekstrakta, a zbroj aktivnosti enzima supernatanta i oborina je ukupna aktivnost enzima.
4. Dovoljno je za 50 reakcije cijevi.
5. Prilog: Težina uzorka(50T/24s)

• Supernatant:

Definicija jedinice: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira konzumaciju 1nmol od 2, 6-diklorindolepheno u 1 min svaki gram težine tkiva.

Složena ⅱ aktivnost(U/g)= =[ΔA1 × VRV ÷(ε × D)× 109]÷(W ÷ ve × vs)÷ t = 476,2 × ΔA1 ÷ W ΔA1: supernatanta apsorpcija;

Vrpca: Ukupni volumen reakcije,1ml;

e.: 2, 6-koeficijent molarnog izumiranja diklorindolepheno, 2.1× 104L/mol/cm; d: Lagani put kivete, 1 cm;

VE: volumen ekstrakta,1ml; Vs: volumen uzorka (ml), 0.05 ml; T: vrijeme reakcije (min), 2 min;

W: Težina uzorka, g.

• Sediment:

Definicija jedinice: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira konzumaciju 1nmol od 2, 6-diklorindolepheno u 1 min svaki gram težine tkiva.

Složena ⅱ aktivnost(U/g)= = [ΔA2 × VRV ÷(ε × D)× 109]÷(W ÷ ve × vs)÷ t = 190,5 × ΔA2 ÷ W ΔA2: sediment apsorbancija;

Vrpca: Ukupni volumen reakcije,1ml;

e.: 2, 6-koeficijent molarnog izumiranja diklorindolepheno, 2.1× 104L/mol/cm; d: Lagani put kivete, 1 cm;

VE: volumen sedimenata,0.4 ml; Vs: volumen uzorka (ml), 0.05 ml;

T: vrijeme reakcije (min), 2 min; W: Težina uzorka, g.

• Ukupna aktivnost je zbroj kompleksne ⅱaktivnosti u supernatantu i sedimentu. Kompleks ⅱ(U/g) = 476,2 × ΔA1 ÷ W+190,5 × ΔA2 ÷ W.

Eksperimentalni primjer:

1. Uzmite 0,1 g uzorka jetre kunića, dodati 1 ML otopine ekstrakta, mljevenje i centrifugiranje homogenata, i djelovati prema koracima određivanja. ΔA1 = a1-a2 = 1.134-1.054 = = 0.08 u supernatantu, i ΔA2 = a1-a2 = 1.371-1.347 = = 0.024 oborine.

Aktivnost kompleksa II u supernatantu (U/g masa) = 476,2 × ΔA1 ÷ w = 476.2 × 0,08 ÷ 0,1 = 380.96 U/g masa

Aktivnost kompleksa II u oborinama (U/g masa) = 190,5 × ΔA2 ÷ W = 190,5 × 0,024 ÷ 0,1 = 45.72

U/g masa

Kompleks II (U/g masa) = 476,2 × ΔA1 ÷ w + 190.5× ΔA2 ÷ w = 476,2 × 0,08 ÷ 0,1 + 190.5× 0,024 ÷ 0.1 = 426,8U/g masa.

Reference：

[1] Mühling J, Tiefenbach M, López-Barneo J, et al. Mitohondrijski kompleks II sudjeluje u normoksičnoj i hipoksičnoj regulaciji α-keto kiselina u mišjem srcu[J]. Časopis za molekularne i stanične kardiologije, 2010, 49(6): 950-961.

Povezani proizvodi：

BC0510/BC0515 kompleks ISTUMPIJA AKTIVNOSTI ELEKTRIČNI TRANCI

BC3240/BC3245 kompleks transportnog lanca elektrona ⅲ Komplet za ispitivanje aktivnosti

BC0940/BC0945 kompleks lanca transporta elektrona ⅳ Komplet za ispitivanje aktivnosti

BC1440/BC1445 kompleks transportnog lanca elektrona ⅴ Komplet za ispitivanje aktivnosti