La protéinase K est un important enzyme utilisé dans les laboratoires de biologie moléculaire pour digérer et éliminer les protéines des préparations d'acide nucléique. Cette enzyme protéolytique a des propriétés clés qui la rendent exceptionnellement utile pour les applications de recherche. Dans ce post, Nous allons explorer ce qu'est exactement la protéinase k, Comment ça fonctionne, Et ses nombreuses utilisations dans le laboratoire.
Qu'est-ce que la protéinase K?
La protéinase K est une sérine protéase à large spectre isolée de l'album Fungus Tritirachium. Il peut rapidement digérer les protéines en fragments de peptides plus petits et acides aminés.
Le nom “protéinase k” vient de sa capacité à digérer la kératine, Une protéine structurelle dure trouvée dans les cheveux, clous, plumes, etc.. L'album Fungus Tritirachium sécrète la protéinase K lorsque la kératine est fournie comme sa seule source d'azote.
Quels sont les faits sur la protéinase k?
Quelques faits clés sur la protéinase k:
- Classification: Appartient à la famille peptidase S8 (famille de subtiliser)
- Type catalytique: Sérine protéase
- PH optimal:5 – 12.0
- Température optimale:50°C – 65°C
- Masse moléculaire:28,930 Et
La protéinase K contient une triade catalytique de trois acides aminés – aspartate, histidine, et sérine. La sérine agit comme un nucléophile qui clive les liaisons peptidiques. Les ions calcium sont importants pour une activité enzymatique complète.
Comment fonctionne la protéinase K?
En tant que sérine protéase, La protéinase K catalyse l'hydrolyse des liaisons peptidiques adjacentes au groupe carboxylique d'acides aminés aliphatiques et aromatiques.
Son mécanisme d'action ressemble à celui d'autres sérine protéases comme la chymotrypsine et la trypsine. Voici les étapes clés:
- La sérine catalytique de l'enzyme initie une attaque nucléophile sur la liaison peptidique carbonyle carbone.
- Cela forme un intermédiaire tétraédrique stabilisé par une liaison hydrogène.
- La liaison d'azote-carbone se brise alors, libérer le premier produit et formant un acyl-enzyme intermédiaire.
- Une molécule d'eau désactive l'enzyme, Libérer le deuxième produit.
- Cela régénère le site de la sérine active pour une autre série de catalyse.
La protéinase K clive les protéines à des liaisons peptidiques intérieures comme endopeptidase. Il n'a pas de spécificité stricte mais préfère les grands résidus hydrophobes. Cela lui permet de décomposer rapidement la plupart des protéines en fragments plus petits.
Qu'est-ce que la protéinase K utilisée pour?
La protéinase K est devenue un réactif essentiel pour la recherche en biologie moléculaire. Voici quelques-unes de ses utilisations les plus courantes:
Digestion des protéines de contamination
Lors de l'isolement de l'ADN ou de l'ARN des cellules et des tissus, La protéinase K est utilisée pour digérer les protéines contaminantes. Cela supprime les impuretés des préparations d'acide nucléique. Ajout de détergents comme FDS aide à exposer les protéines pour une digestion améliorée.
Inactiver les nucléases
De nombreuses nucléases qui peuvent dégrader l'ADN et l'ARN sont eux-mêmes des protéines. La protéinase K inactive rapidement ces nucléases nocives par clivage protéolytique. Cela protège les acides nucléiques isolés de la dégradation.
Digestion des tissus
La protéinase K peut aider à dissocier les cellules et à solubiliser les tissus, libérer des acides nucléiques pour l'extraction. Il est inclus dans les tampons de lyse tissulaire pour les protocoles de purification ADN / ARN.
Analyse des protéines
La protéase produit des fragments de peptide spécifiques qui fournissent des informations sur la structure des protéines. Les modèles de digestion de la protéinase K sont utiles pour étudier les domaines protéiques, sites de modification, etc..
Inactiver les prions infectieux
Comme endopeptidase, La protéinase K peut digérer les protéines prions mal repliées responsables des encéphalopathies spongiformes transmissibles comme la maladie de Creutzfeldt-Jakob. Il est utilisé pour inactiver la contamination par prion.
Séquençage de l'ADN
Certaines méthodes de séquençage d'ADN utilisent la protéinase K pour éliminer l'ADN polymérase après extension de séquence, Préparer l'ADN pour l'électrophorèse.
Hybridation in situ
L'enzyme peut perméabiliser doucement les cellules / tissus fixes pour l'hybridation des sondes nucléotidiques tout en préservant l'ARN et l'intégrité de l'ADN.
De quelles conditions la protéinase K a-t-elle besoin?
Voici les conditions que la protéinase K nécessite à fonctionner correctement.
Température
La protéinase K présente une activité élevée de 50 ° C à 65 ° C, avec une température optimale d'environ 60 ° C. Il conserve une certaine capacité protéolytique même à 37 ° C. Les températures plus élevées rendent probablement les structures de protéines plus accessibles.
pH
Cette enzyme fonctionne sur une large gamme de pH du pH 4 à pH 12, avec une activité maximale entre le pH 7.5 et 12. Les conditions alcalines sont les meilleures, Mais le pH neutre fonctionne également bien.
Détergents
Ajout de détergents ioniques comme SDS (dodécyl sulfate de sodium) peut améliorer l'activité de la protéinase K en dénaturant les substrats protéiques. Détergents non ioniques comme Triton X-100 travailler également.
Cations divalents
La protéinase K nécessite des ions calcium pour une activité et une stabilité enzymatiques complètes. Edta chélates calcium et peut inhiber l'enzyme. Cependant, La protéinase K conserve toujours une fonction sans calcium.
Comment la protéinase K est-elle utilisée dans le laboratoire?
La protéinase K a des fonctions importantes en laboratoire et elle est utilisée dans le laboratoire de la manière suivante:
Recette de tampon protéinase k
Un tampon de digestion typique de la protéinase K contient:
- 10 mM Tris-HCl pH 8.0
- 100 mMNaCl
- 5% FDS
- 50 μg / ml de protéinase k
Le Tris maintient un pH alcalin de autour 8.0. NaCl fournit une certaine force ionique. SDS dénatures les protéines pour la digestion. Le tampon peut être modifié selon les besoins.
Protocole de digestion
- Ajouter la protéinase K au tampon juste avant l'utilisation.
- Incuber des échantillons dans le tampon pour 30 min 2 HRS à 50 ° C à 65 ° C.
- Inactiver la protéinase K par chauffage à 95 ° C pour 10 min ou utiliser PMSF.
Des digests plus longs ou une température plus élevée peuvent augmenter l'activité. Le contexte de l'échantillon dicte des conditions optimales.
Prudence!
La protéinase K est une protéase très puissante. Il faut prendre soin d'éviter de contaminer des échantillons ou des protéines dégradantes censées être analysées. Portez toujours des gants et utilisez des fournitures dédiées.
Comment la protéinase K est-elle inactivée?
Une fois que la protéinase K a servi son objectif, il doit être inactivé pour arrêter la digestion supplémentaire. Voici quelques méthodes:
- Chauffage: Les températures supérieures à 90 ° C inactivent rapidement l'enzyme. Cependant, Le chauffage n'élimine pas complètement l'activité résiduelle.
- PMSF: Cet inhibiteur irréversible de la sérine protéase modifie de manière covalente la sérine catalytique, Activité de blocage en permanence.
- AEBSF: Un autre inhibiteur de la sérine protéase qui inactive définitivement la protéinase k.
- TCA: Dénatures à l'acide trichloroacétique et précipite l'enzyme.
Le chauffage est la méthode la plus pratique, Mais les inhibiteurs de la sérine protéase fournissent une inactivation complète.
Quelles sont certaines alternatives à la protéinase k?
Certaines alternatives de la protéinase K incluent:
- Pronase: Un mélange de protéase non spécifique isolé de Streptomyces griseus.
- Trypsine: Une sérine protéase avec spécificité pour la lysine et l'arginine.
- Pepsine: Une protéase aspartique du jus gastrique des mammifères. Fonctionne mieux dans des conditions acides.
- Papaïne: Une protéase cystéine de la papaye. Souvent utilisé pour la dissociation cellulaire.
Chacun a un certain chevauchement avec la protéinase K dans les protéines dégradantes, Mais leurs propriétés spécifiques diffèrent. La protéinase K est toujours la plus utilisée à des fins de laboratoire générale.
Conclusion
La puissante sérine protéase protéinase K est indispensable pour la recherche et le diagnostic en biologie moléculaire. Sa capacité remarquable à digérer rapidement les protéines tout en restant active dans des conditions difficiles en fait l'enzyme incontournable pour éliminer les protéines de contaminer et protéger les acides nucléiques.
Comprendre ce qu'est la protéinase k, Comment ça fonctionne, Et ses conditions de travail optimales permettent aux chercheurs d'exploiter son plein potentiel en laboratoire. Cette protéase polyvalente continue de permettre d'innombrables techniques en éliminant les protéines interférentes et en inactivant les nucléases nocives pour récupérer l'ADN et l'ARN de la pureté la plus élevée.
