Qu'est-ce que la PCR in situ? À quoi sert-il?

En site RAP, ou réaction en chaîne par polymérase in situ, est une technique utilisée dans la recherche scientifique. Chaque nouvelle technologie développée en science provoque une série de nouveaux résultats de recherche, conduisant ainsi l'avancement de diverses disciplines.

Le développement de la PCR in situ

• Dans les années 1950, L'introduction de la microscopie électronique en observation morphologique a provoqué des recherches approfondies du niveau cellulaire au niveau subcellulaire.
• Dans les années 1960 et 1970, L'application généralisée des techniques d'immunohistochimie et d'immunocytochimie a poussé l'observation des structures subcellulaires au niveau des molécules protéiques, permettant la localisation de nombreuses substances actives dans les cellules ou au niveau subcellulaire, impactant profondément le développement de la biologie médicale.
• Dans les années 1970, L'application approfondie des techniques de biologie moléculaire en morphologie, ainsi que l'émergence de la technologie d'hybridation in situ, Activé la localisation de séquences d'ADN ou d'ARN spécifiques dans les cellules tissulaires, augmenter le niveau d'observation et de localisation des protéines au niveau génétique, à savoir les molécules d'acide nucléique. Cette compréhension humaine approfondie de nombreux phénomènes biologiques au niveau génétique.
• Dans les années 1980, RAP (réaction en chaîne par polymérase), Une technique robuste vitale dans le domaine de la biologie moléculaire, émergé. Il a été rapidement introduit dans le domaine de l'observation morphologique, permettant la localisation et l'observation d'ADN ou d'ARN spécifique avec des nombres de copies faibles ou des copies uniques dans les cellules. L'avènement de cette technique est tenu de provoquer plus de résultats de recherche, propulser des études morphologiques en avant par une foulée significative.

Les principes de la PCR in situ

• Principe de base: La PCR in situ combine l'amplification à haute efficacité de la PCR avec la localisation cellulaire de l'hybridation in situ pour détecter des séquences d'ADN ou d'ARN spécifiques dans les cellules tissulaires.
• TECHNIQUE DE PCR: Utilise l'ADN polymérase pour amplifier des séquences cibles spécifiques par dénaturation, recuit, et cycles d'extension, résultant en une amplification très sensible et spécifique.
• Limites de la PCR traditionnelle: La PCR traditionnelle est réalisée en phase liquide, nécessitant une perturbation cellulaire et une extraction d'acide nucléique avant l'amplification, Rendre difficile de corréler les résultats de la PCR avec la morphologie cellulaire et d'identifier les types de cellules contenant des séquences cibles spécifiques.
• Avantages de la PCR in situ: Combine les forces de la PCR et des techniques d'hybridation in situ tout en dépassant leurs limites respectives.
• Procédure: Les échantillons de tissus sont chimiquement fixés pour maintenir la morphologie cellulaire. La perméabilité des membranes cellulaires et nucléaires permet aux composants de PCR de pénétrer dans les cellules ou les noyaux, où ils amplifient l'ARN ou l'ADN fixé dans la situation. Produits amplifiés, Typiquement de grandes molécules ou structures entrelacées, sont conservés in situ et facilement détectés par hybridation in situ.
• Avantages: Permet l'amplification exponentielle de séquences d'ADN ou d'ARN spécifiques dans les cellules, faciliter leur détection par hybridation in situ.

Types de base de PCR in situ

Les techniques de PCR in situ peuvent être classées en deux types principaux: Méthode directe et méthode indirecte, en fonction de savoir si les nucléotides ou amorces triphosphates utilisés dans la réaction d'amplification sont marqués. En plus, Il y a la technique de PCR in situ de transcription inverse.

Technique de PCR de méthode directe:

• Dans la méthode directe, Les produits d'amplification sont directement étiquetés avec des molécules de marqueur, comme les fragments de triphosphate étiquetés ou les fragments d'amorce. Pendant l'amplification PCR de l'échantillon, Les molécules marquées sont incorporées dans les produits amplifiés, permettant la visualisation de l'ADN ou de l'ARN spécifique dans l'échantillon (en site).
• Les marqueurs courants incluent des isotopes radioactifs comme les 35, biotine, et digoxigénine. Ces marqueurs’ Les emplacements peuvent être détectés à l'aide de méthodes telles que l'autoradiographie pour les isotopes radioactifs ou la chimie des tissus d'affinité et l'immunohistochimie pour la biotine et la digoxigénine.
• Les avantages de la méthode directe comprennent la simplicité, temps de traitement plus court, et facilité de fonctionnement. Cependant, il présente des inconvénients tels que la spécificité inférieure, Plus grande probabilité de faux positifs, et une efficacité d'amplification inférieure, en particulier sur les sections de paraffine où les dommages à l'ADN pendant la section peuvent entraîner des faux positifs.
• Méthode indirecte Technique PCR in situ:

Méthode indirecte Technique PCR in situ:

• Dans la méthode indirecte, L'amplification spécifique de l'ADN ou de l'ARN est d'abord effectuée dans les cellules, suivi d'une hybridation in situ à l'aide de sondes marquées, Améliorer considérablement la spécificité. C'est actuellement la technique de PCR in situ la plus utilisée.
• Contrairement à la méthode directe, Le système de réaction est similaire à la PCR conventionnelle, sans amorces marquées ni adénosine triphosphate utilisée. Le but est d'amplifier d'abord, Détectez ensuite les produits d'ADN spécifiques amplifiés dans les cellules en utilisant une technologie d'hybridation in situ. Il combine efficacement les techniques de PCR et d'hybridation in situ, également connu sous le nom d'hybridation PCR in situ (Battre).
• Les avantages de la méthode indirecte comprennent une spécificité et une efficacité d'amplification plus élevées, mais il implique des étapes opérationnelles plus complexes que la méthode directe.

Technique de PCR de transcription inverse in situ:

• PCR de transcription inverse in situ (RT-PCR in situ) est une nouvelle technique qui applique la technologie RT-PCR en phase liquide aux échantillons de cellules tissulaires. Contrairement à RT-PCR en phase liquide, Les échantillons de tissus sont traités avec des enzymes d'ADN avant la PCR inverse de transcription inverse pour détruire l'ADN tissulaire, s'assurer que le modèle amplifié est synthétisé par l'ADNc à partir de l'ARNm, Pas l'ADN d'origine dans les cellules. D'autres étapes de base sont similaires au RT-PCR en phase liquide.

Comment exécuter un test de PCR in situ?

Les étapes de base de la technologie de PCR in situ incluent la préparation des échantillons, amplification in situ (RAP), et détection in situ, comme indiqué ci-dessous (en mettant l'accent sur les sections de paraffine):

La préparation des échantillons:

• Les techniques de PCR in situ peuvent être appliquées aux suspensions cellulaires, frottis cellulaires, sections surgelées, et sections de paraffine.
• Par rapport à d'autres méthodes, La PCR in situ donne les meilleurs résultats avec des cellules intactes en suspension, tandis que les sections de paraffine donnent les résultats les plus pauvres.
• Certaines raisons de mauvaise performance comprennent:
  • Mauvaise conductivité thermique et convection de chaleur inégale lors de la conduite de la PCR sur les diapositives.
  • Adsorption enzymatique de l'ADN Taq aux lames de verre.
  • Après le traitement des échantillons, Les cellules manquent de cytoplasme intact ou de membranes nucléaires, conduisant à la diffusion des produits d'amplification et à des difficultés à les conserver in situ.
• La plupart des échantillons de pathologie sont fixés avec du formol et conservés en paraffine.
• La résolution des problèmes techniques liés à la PCR in situ sur les sections de paraffine serait très importante.

Fixation des cellules tissulaires: Les cellules tissulaires sont généralement fixées avec 10% formol tamponné ou 4% paraformaldéhyde pour de meilleurs résultats en PCR in situ. Le temps de fixation ne doit pas être excessivement long, typiquement 4-6 heures à 4 ° C.

Épaisseur: Les tranches plus épaisses donnent généralement de meilleurs résultats dans la PCR in situ car elles contiennent plus de structures d'ADN et de membrane cibles, Prévenir la diffusion des produits d'amplification. Cependant, Des tranches plus épaisses peuvent entraîner un chevauchement cellulaire et une résolution diminuée dans l'observation morphologique.

Glissement: Pour éviter le détachement des sections de paraffine pendant la PCR et l'hybridation in situ, Les lames doivent être traitées pour éviter le détachement. Les méthodes courantes incluent le revêtement avec du poly-lysine ou du traitement de la silanisation, qui empêchent généralement le détachement tissulaire.

Digestion de la protéase:

Amplification in situ (RAP): L'amplification in situ consiste à effectuer des réactions de PCR sur des échantillons de cellules tissulaires, le principe de base étant le même que celui de la PCR en phase liquide. Les amorces utilisées en PCR sont généralement 15-30bp, et les fragments amplifiés sont d'environ 100-1000bp.

Système de réaction:

• Le système de réaction pour la PCR in situ est similaire à celui de la PCR en phase liquide conventionnelle.
• Concentrations plus élevées d'amorces, Taqdna polymérase, et Mg2 + sont suggérés pour de meilleurs résultats d'amplification sur les tranches de tissus fixes par rapport aux systèmes de PCR en phase liquide.
• Albumine sérique bovine (BSA) doit être ajouté au système de réaction pour empêcher l'ADN polymérase TAQ de se lier aux lames de verre et de réduire l'efficacité de l'amplification.

Cyclisme thermique:

• Le cyclisme thermique pour la PCR in situ peut être effectué dans un thermale thermique spécialisé ou un cycleur thermique PCR ordinaire.
• Chaque étape du cycle thermique de la PCR in situ peut être légèrement plus longue que dans la PCR conventionnelle pour assurer une amplification adéquate.
• Une méthode de démarrage à chaud peut être utilisée pour minimiser la perte du système de réaction pendant le cycle thermique.

Lavage:

• Après une amplification in situ, Les échantillons doivent subir un lavage pour éliminer les produits d'amplification qui ont diffusé les cellules extérieures.
• Un lavage inadéquat peut entraîner une visualisation des produits d'amplification pendant la détection, entraînant des arrière-plans excessivement sombres ou des résultats faux positifs.
• Un lavage excessif peut également entraîner l'élimination des produits amplifiés à l'intérieur des cellules, affaiblir ou perdre des signaux positifs.

Post-fixation: Certains auteurs ont rapporté utiliser 4% paraformaldéhyde pour 2 heures ou 2% glutaraldéhyde pour 5 Minutes de post-fixation après amplification pour s'assurer que les produits amplifiés sont bien conservés dans les cellules pendant la détection, améliorant ainsi la sensibilité et la spécificité de la détection.

Détection in situ: La méthode de détection des produits d'amplification de la PCR in situ dépend de la conception du protocole de PCR in situ. Les méthodes directes détectent directement les produits amplifiés en fonction de la nature des molécules marquées, tandis que les méthodes indirectes nécessitent une détection par hybridation in situ.

L'application de la PCR in situ

Détection de gènes exogènes

• Détection de gènes viraux:
  • Dans les cellules infectées par des virus, La détection peut être difficile. Cependant, La PCR in situ offre de l'espoir de résoudre cette difficulté.
  • La PCR in situ a été appliquée avec succès pour observer le rôle de divers virus tels que le VIH, VPH, HSV, VHB, VHC, etc., Dans des conditions comme le sida, tumeurs du système reproducteur, hépatite, et cancer du foie, permettant l'identification opportune des individus infectés.
• Détection des gènes bactériens:
  • Une application proéminente est dans la détection de Mycobacterium tuberculosis. Lorsque les lésions de la tuberculose sont atypiques, Il est difficile d'identifier les bactéries au microscope en utilisant des méthodes de coloration spéciales. La PCR in situ peut aider à faire un diagnostic définitif, Même lorsque la présence de Mycobacterium tuberculosis est minime.
• Détection de gènes importés:
  • Dans l'étude des animaux transgéniques, Confirmation de l'importation de gènes, ainsi que chez les patients subissant une thérapie génique, peut être vérifié à l'aide de PCR in situ. Ainsi, La PCR in situ est devenue une méthode de détection importante.

Détection de gènes endogènes

Détection de gènes anormaux:

• Détection de mutation et de réarrangement:
  • La PCR in situ est capable de détecter les mutations et les réarrangements dans les gènes du corps.
  • Mutations dans les proto-oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs, ainsi que les réarrangements des gènes de chaîne lourde immunoglobulines, sont des exemples d'altérations génétiques détectées à l'aide de PCR in situ.
• Applications en recherche et diagnostic du cancer:
  • Ces mutations et réarrangements jouent un rôle crucial dans le développement et la progression du cancer.
  • La PCR in situ offre de vastes applications dans la recherche et le diagnostic du cancer en permettant la détection précise de ces altérations génétiques.
  • Il facilite la compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent le cancer et le sida dans le développement de thérapies ciblées.

Détection de gènes constitutifs:

• Défis de l'expression des gènes de bas niveau:
  • Les gènes constitutifs exprimés à de faibles niveaux posent des défis pour les méthodes de détection.
  • Les techniques d'hybridation in situ sont inefficaces en raison des nombres de copies de gènes limités dans les cellules du corps.
• Limites de la PCR en phase liquide:
  • La PCR en phase liquide peut amplifier et détecter les gènes de bas niveau mais manque de spécificité de type cellulaire.
  • Il ne peut pas déterminer quel type de cellule contient le gène cible avec précision.
• Avantages de la PCR in situ:
  • La PCR in situ surmonte ces limites.
  • Il permet la détection de divers gènes humains, même ceux exprimés à de faibles niveaux.
  • La PCR in situ contribue à l'achèvement de la carte des gènes humains en fournissant une localisation de gènes précise dans des types de cellules spécifiques.