Développement de la technologie PCR
- Réaction en chaîne par polymérase (RAP) est une technique de biologie moléculaire utilisée pour amplifier des fragments d'ADN spécifiques.
- Il peut être considéré comme un type spécial de réplication d'ADN qui se produit en dehors des organismes vivants.
- ADN polymérase dans laquelle j'ai été découvert pour la première fois 1955.
- Le fragment klenow de e. coli, Découvert au début des années 1970 par le Dr. H. Klenow, a une valeur expérimentale et une pratique.
- Cependant, Cette enzyme n'est pas résistante à la chaleur et des dénatures à des températures élevées, le rendre inadapté à une utilisation dans la PCR qui nécessite une dénaturation à haute température.
- L'enzyme couramment utilisée aujourd'hui, appelé Taq polymérase, a été isolé de la bactérie Thermus aquaticus 1976.
- Sa caractéristique de la résistance à la chaleur en fait une enzyme idéale, Mais son utilisation généralisée est venue après les années 1980.
- Le concept original de PCR, Similaire à la réplication de la réparation des gènes, a été proposé par Dr. Kjell Kleppe 1971.
- Il a publié la première expérience de réplication des gènes purs et transitoires (Similaire aux deux premiers cycles de PCR).
- La PCR développée aujourd'hui a été lancée par DR. Kary b. Réfléchir à 1983, Quand Mullis a travaillé pour l'entreprise PE, Donner à l'entreprise un poste spécial dans le domaine de la PCR.
- Mullis et Saiki ont officiellement publié le premier article connexe dans 1985.
- Depuis lors, L'application de la PCR s'est développée rapidement, et la qualité des articles connexes a dépassé de nombreuses autres méthodes de recherche.
- Ensuite, La technologie de PCR a été largement utilisée dans la recherche biologique et les applications cliniques, Devenir une technique cruciale dans la recherche en biologie moléculaire.
- Mullis a reçu le prix Nobel de chimie en 1993 pour sa contribution.
Le principe de la PCR
Le principe de base de la technologie PCR est similaire au processus de réplication naturel de l'ADN, et sa spécificité dépend des amorces oligonucléotidiques qui sont complémentaires à la séquence cible aux deux extrémités. La PCR se compose de trois étapes de réaction de base: dénaturation, recuit, et extension:
- Dénaturation de l'ADN de matrice: Après avoir chauffé le modèle ADN à environ 93 ° C pendant une certaine période, L'ADN double brin de l'ADN de matrice ou de l'ADN double brin formé par amplification par PCR est dissocié, le rendre simple brin pour qu'il puisse se lier aux amorces et se préparer à la prochaine série de réaction.
- Recuit (réassociation) de l'ADN et d'amorces de matrice: Une fois que le modèle ADN est dénaturé en brins simples, La température est réduite à environ 55 ° C, et les séquences complémentaires des amorces et la paire d'ADN à modèle simple brin et se lient et se lient.
- Extension des amorces: Avec l'action de l'ADN polymérase Taq, Utilisation de DNTP comme substrats de réaction et la séquence cible comme modèle, Selon le principe de l'appariement de la base complémentaire et de la réplication semi-conservatrice, Une nouvelle chaîne de réplication semi-conservatrice complémentaire de la chaîne d'ADN de matrice est synthétisée. Cette chaîne peut être amplifiée en millions d'exemplaires du gène cible à l'intérieur 2 à 3 heures en répétant la dénaturation, recuit, et processus d'extension.
Système de réaction de PCR et conditions de réaction Système de réaction PCR standard
| Composant | Volume / concentration |
|---|---|
| 10x tampon d'amplification | 10µl |
| 4 Types de mélange DNTP | 200µl |
| Apprêts | 10-100µl |
| ADN de modèle | 0.1-2µg |
| Taq ADN polymérase | 2.5µl |
| Mg2 + | 1.5mmol / L |
| Double ou triple eau distillée | 100µl |
Les cinq éléments de la réaction de PCR:
- Apprêts (Les amorces de PCR sont des fragments d'ADN, tandis que les amorces pour la réplication de l'ADN cellulaire sont des chaînes d'ARN)
- Enzyme
- dNTP
- Modèle
- Tampon (qui nécessite mg2 +)
Le processus de PCR standard se compose de trois étapes:
- Dénaturation de l'ADN (90° C-96 ° C): Sous l'influence de la chaleur, Les liaisons hydrogène dans le modèle d'ADN double brin se brisent, formant l'ADN simple brin.
- Recuit (25° C-65 ° C): La température du système diminue, Permettre aux amorces de se lier au modèle d'ADN, Former des régions locales à double brin.
- Extension (70° C-75 ° C): Avec l'action de la polymérase Taq (activité optimale autour de 72 ° C), Utilisation de DNTP comme substrats, L'extension se produit à partir du 5′ fin au 3′ fin de l'amorce, synthétisant un brin d'ADN complémentaire au modèle.
Remarques:
- Chaque cycle subit une dénaturation, recuit, et extension, doubler la quantité d'ADN.
- Certains protocoles de PCR, En raison de la région de l'amplification courte, peut terminer la réplication même si l'activité Taq polymérase n'est pas optimale.
- Dans ces cas, Une méthode en deux étapes peut être utilisée, où le recuit et l'extension se produisent simultanément à une température comprise entre 60 ° C et 65 ° C, Réduire le nombre de cycles de température et ainsi améliorer la vitesse de réaction.
Caractéristiques de réaction de PCR
Spécificité forte
La spécificité de la réaction de PCR est déterminée par:
- Liaison spécifique et correcte des amorces à l'ADN de matrice.
- Principes de jumelage de base.
- Fidélité de la réaction de synthèse de l'ADN polymérase TAQ.
- Spécificité et conservation du gène cible.
Remarques:
- La liaison correcte des amorces au modèle est cruciale.
- La liaison des amorces au modèle et l'extension des chaînes d'amorces suivent les principes de l'appariement de base.
- La fidélité de la réaction de synthèse de polymérase et la résistance à la chaleur de l'ADN polymérase Taq permettent le recuit (réassociation) du modèle et des amorces à se produire à des températures plus élevées, Augmenter considérablement la spécificité de la liaison et du maintien d'un haut niveau de précision pour le segment de gène cible amplifié.
- En outre, en sélectionnant des régions de gènes cibles avec une spécificité et une conservation élevées, Le niveau de spécificité augmente encore.
Sensibilité élevée
- La quantité de produit PCR augmente de façon exponentielle, Activer l'amplification des montants de modèle de démarrage à partir de picogrammes (pg = 10 ^ -12) aux microgrammes (μg = 10 ^ -6).
- Il peut détecter une cellule cible à partir d'un million de cellules.
- En détection de virus, La sensibilité à la PCR peut atteindre 3 RFU (unités de formation recombinante), En bactériologie, Le taux de détection minimum est 3 bactéries.
Simple et rapide
- Les réactions de PCR utilisent l'ADN polymérase TAQ résistante à la chaleur.
- Une fois le mélange réactionnel préparé, dénaturation, recuit, et des réactions d'extension sont effectuées sur un liquide d'amplification d'ADN et un bain-marie, terminant généralement la réaction d'amplification en 2 à 4 heures.
- Les produits d'amplification sont généralement analysés par électrophorèse, Sans la nécessité d'utiliser des isotopes, minimisant ainsi la contamination radioactive et facilitant la dissémination.
Exigences de pureté faibles pour les spécimens
- Il n'est pas nécessaire d'isoler les virus ou les bactéries ou les cellules de culture; L'ADN et l'ARN bruts peuvent être utilisés comme modèles d'amplification.
- Des spécimens cliniques comme le sang, fluides corporels, expectorations, cheveux, cellules, et les tissus vivants peuvent être directement utilisés pour la détection d'amplification de l'ADN.
Dépannage de la PCR
Faux négatifs
L'absence de bandes d'amplification dans les réactions de PCR est souvent causée par des facteurs clés:
Template Préparation d'acide nucléique
- Contaminants tels que les protéines dans le modèle, La présence d'inhibiteurs de Taq polymérase, Élimination incomplète des protéines (en particulier les histones) à partir de l'ADN chromosomique, Perte excessive pendant l'extraction du modèle, ou l'inhalation du phénol peut contribuer au problème.
- La dénaturation incomplète des acides nucléiques de modèle peut également jouer un rôle.
- Lorsque les qualités enzymatiques et amorces sont bonnes, Et les bandes d'amplification n'apparaissent pas, Il est probablement dû à des problèmes de digestion ou des défauts dans le processus d'extraction d'acide nucléique.
- Des solutions de digestion efficaces et stables doivent être préparées, et la procédure doit rester fixe.
Inactivation enzymatique
Cela peut nécessiter de remplacer l'enzyme par une nouvelle ou en utilisant une combinaison d'anciennes et nouvelles enzymes pour analyser si la perte d'activité enzymatique ou l'insuffisance conduit à de faux négatifs. Parfois, Oublier d'ajouter la Taq polymérase ou le bromure d'éthidium peut également causer des problèmes.
Problèmes d'amorce
- Qualité et concentration d'amorces, Symétrie des concentrations d'amorces, et les variations de lots de la qualité de la synthèse des amorces peuvent avoir un impact.
- Les solutions incluent la sélection des unités de synthèse d'amorces réputées, Confirmation des concentrations d'amorces par électrophorèse sur gel d'agarose, Assurer des intensités de groupes similaires pour les deux amorces, Stockage des amorces à des concentrations élevées dans de petites aliquotes pour éviter la dégradation, et assurer la conception rationnelle des amorces pour éviter des problèmes comme la formation de dimères d'amorce.
Concentration Mg2 +
La concentration en ions Mg2 + affecte de manière significative l'efficacité de l'amplification de la PCR. Des concentrations excessives ou inadéquates peuvent affecter la spécificité ou le rendement, conduisant à une amplification ratée.
Modifications du volume de réaction
Les volumes de PCR varient généralement de 20 μl à 100 μl, en fonction de l'objectif. La modification des volumes doit être soigneusement ajustée pour éviter les échecs.
Facteurs physiques
La dénaturation est cruciale, et la dénaturation ou les températures de recuit inadéquate peuvent provoquer des faux négatifs. L'utilisation de thermomètres standard pour vérifier les températures du thermocycleur ou du bain-marie peut aider à prévenir les échecs.
Variations de séquence cible
Des mutations ou des suppressions dans la séquence cible peuvent affecter la liaison, conduisant à une amplification ratée.
Faux positifs
Les bandes d'amplification PCR observées correspondent aux bandes de séquence cible, apparaissant parfois plus uniforme et plus brillant. Causes possibles:
Conception d'amorce inappropriée:
La sélection de séquences d'amplification avec homologie à des séquences non ciblées peut entraîner des produits d'amplification non spécifiques pendant la PCR. De courtes séquences ou amorces cibles peuvent conduire à de faux positifs. Les amorces de refonte sont nécessaires.
Contamination croisée des séquences cibles ou des produits d'amplification:
Contamination Causes:
- La contamination de l'ensemble du génome ou de grands segments peut conduire à de faux positifs.
- La contamination des petits fragments d'acide nucléique dans l'air peut également provoquer de faux positifs.
Comment gérer cette situation
1. Pratiques de laboratoire strictes:
- Gérer les échantillons avec soin pour empêcher l'inhalation de séquences cibles dans des pipettes ou éclabousser les tubes à centrifugeuse à l'extérieur.
- Autoclave tous les réactifs et équipements, à l'exception des enzymes et des matériaux intolérants à des températures élevées.
- Utilisez des tubes à centrifugeuse jetables et des conseils de pipette pour minimiser la contamination.
2. Exposition aux UV:
- Exposer les tubes de réaction et les réactifs à la lumière ultraviolette avant l'ajout de l'échantillon pour détruire les acides nucléiques existants.
- Considération de conception d'amorce:
- Concevoir soigneusement les amorces pour minimiser le potentiel de réactivité croisée avec des séquences non cibles.
- Méthodes de PCR imbriquées:
- Mettre en œuvre des méthodes de PCR imbriquées pour atténuer ou éliminer les faux positifs causés par la contamination des petits fragments d'acide nucléique dans l'air.
Apparence de bandes d'amplification non spécifiques
- Après l'amplification PCR, Les groupes apparaissent qui sont de taille incohérente avec ceux attendus, soit plus grand ou plus petit, ou les bandes spécifiques et non spécifiques apparaissent simultanément.
- Les raisons de l'apparition de bandes non spécifiques sont:
- Complémentarité incomplète entre les amorces et les séquences cibles, ou formation de dimère d'amorce.
- Concentration en ions Mg2 + excessive, Température de recuit trop basse, et numéro de cycle de PCR excessif.
- Qualité et quantité de l'enzyme, avec des enzymes de certaines sources sujets aux bandes non spécifiques, tandis que d'autres ne sont pas.
- La quantité enzymatique excessive peut parfois conduire à une amplification non spécifique.
- Les contre-mesures comprennent:
- Reviser les amorces si nécessaire.
- Réduire la quantité enzymatique ou passer à des enzymes de différentes sources.
- Abaissement de la concentration d'amorce, Augmentation de la concentration de modèle de manière appropriée, et réduire le nombre de cycles.
- Augmenter la température de recuit de manière appropriée ou adopter une méthode de point à deux températures (dénaturation à 93 ° C, recuit et extension à environ 65 ° C).
Apparence de bandes de maculage ou de stade
L'amplification par PCR entraîne parfois des bandes de maculage ou de stade.
- Ceci est souvent causé par une quantité enzymatique excessive ou une mauvaise qualité enzymatique, Haute concentration de DNTP, Concentration excessive de Mg2 +, faible température de recuit, ou numéro de cycle excessif.
- Les contre-mesures comprennent:
- Réduire la quantité enzymatique ou passer à des enzymes de différentes sources.
- Diminution de la concentration de DNTP.
- Abaissement de manière appropriée Mg2 + Concentration.
- Quantité de modèle croissante.
- Réduction du numéro de cycle.
