Introduction de la PCR situ
Dans la recherche scientifique, La création de chaque nouvelle technologie provoque une série de nouvelles résultats de recherche, avançant ainsi diverses disciplines. Dans le domaine de la recherche morphologique, L'introduction du microscope électronique dans les années 1950 a amené des études détaillées du niveau cellulaire au niveau subcellulaire.
Dans les années 1960 et 1970, L'application généralisée des technologies d'immunohistochimie et d'immunocytochimie a poussé les observations des structures subcellulaires au niveau moléculaire des protéines, permettant la localisation de nombreuses substances actives dans les cellules ou les niveaux subcellulaires. Cela a eu un impact profond sur le développement de la biologie médicale.
Les années 1970 ont vu l'application approfondie des techniques de biologie moléculaire en morphologie, Et avec l'avènement de l'hybridation in situ, Des séquences d'ADN ou d'ARN spécifiques dans les tissus et les cellules pourraient être localisées. Ces observations avancées du niveau de protéine au niveau du gène, Ainsirant ainsi la compréhension humaine de nombreux phénomènes de vie au niveau génétique.
Dans les années 1980, Une technique puissante dans le domaine de la biologie moléculaire, RAP (réaction en chaîne par polymérase), a été présenté. Il a été rapidement adopté dans les études morphologiques, permettant la localisation et l'observation de l'ADN ou de l'ARN ou de l'ARN à copie à faible copie spécifique dans les cellules. L'avènement de cette technologie promet d'apporter plus de résultats de recherche, faire des études morphologiques un pas en avant significatif.
Principes fondamentaux
Le principe de base de la technologie de PCR in situ est de combiner l'amplification à haute efficacité de la technologie PCR avec la localisation cellulaire de l'hybridation in situ. Cela permet la détection in situ de séquences d'ADN ou d'ARN à faible copie ou à copie spécifique dans les cellules tissulaires.
La technologie de PCR amplifie des séquences cibles spécifiques guidées par les amorces à travers les cycles de dénaturation, recuit, et extension d'amorce sous l'action de l'ADN polymérase. Les séquences cibles amplifiées (peut généralement être amplifié par 10 ^ 6 fois) sont facilement affichés grâce à une électrophorèse sur gel ou à une hybridation de transfert du Sud. Donc, La technologie de PCR est très sensible et spécifique, et avec l'automatisation et la stabilité du cyclisme thermique, il devient facile à utiliser. Cependant, La PCR est effectuée en phase liquide, nécessitant une perturbation cellulaire pour extraire les acides nucléiques comme modèles avant l'amplification. Il est difficile de corréler les résultats de la PCR avec la structure morphologique des cellules tissulaires et de déterminer le type de cellule contenant la séquence cible spécifique.
La technologie de PCR in situ combine avec succès la PCR et l'hybridation in situ, conserver les avantages des deux tout en compensant leurs lacunes respectives. Les échantillons de PCR in situ sont généralement fixes chimiquement pour maintenir de bonnes structures morphologiques des cellules tissulaires. Les membranes cellulaires et les membranes nucléaires ont une certaine perméabilité, Permettre des composants tels que les amorces, ADN polymérase, et les nucléotides pour entrer dans les cellules ou les noyaux pendant l'amplification de la PCR. L'ARN ou l'ADN ou l'ADN intracellulaire ou intranucléaire fixe sert de modèles pour une amplification in situ. Les produits amplifiés sont généralement de grandes molécules ou entrelacent les uns avec les autres, ce qui leur rend difficile de diffuser à travers la membrane cellulaire ou dans la membrane, Ainsi retenu in situ. Par ici, Les séquences d'ADN ou d'ARN spécifiques à faible copie ou à copie unique d'origine sont amplifiées de façon exponentielle in situ, et les produits amplifiés peuvent être facilement détectés par des techniques d'hybridation in situ.
Types de base
Selon que les nucléotides ou les amorces utilisés dans la réaction d'amplification sont marqués, La technologie de PCR in situ peut être divisée en deux grandes catégories: méthodes directes et indirectes. En plus, Il y a la technologie PCR de transcription inverse in situ.
Technologie PCR directe in situ in situ
Technologie de PCR directe in situ directe, Le produit amplifié porte directement une molécule marquée, c'est-à-dire, en utilisant des fragments d'adénosine marqués ou des fragments d'amorce. Lorsque l'échantillon subit une amplification PCR, Les molécules marquées sont incorporées dans le produit amplifié, Affichage des marqueurs, rendant ainsi l'ADN ou l'ARN spécifique visible dans l'échantillon (sur place).
Les marqueurs courants incluent l'isotope radioactif ³⁵, biotine, et digoxigénine. Ces marqueurs’ Les positions sont visualisées en utilisant l'autoradiographie, Histochimie d'affinité, ou méthodes d'immunohistochimie.
Avantages:
- Opération simple
- Bref procédé
- Salon
Désavantage:
- Spécificité plus faible
- Sujet aux faux positifs
- Efficacité d'amplification plus faible, Surtout dans les sections de paraffine
Ces inconvénients sont importants dans les sections de paraffine en raison de dommages potentiels à l'ADN pendant le traitement (fixation, déshydratation, intégration). L'ADN endommagé peut être réparé à l'aide des nucléotides marqués, conduisant à de faux positifs. L'utilisation d'amorces étiquetées dans la PCR directe in situ réduit encore l'efficacité d'amplification.
Technologie PCR indirecte in situ in situ
La technologie de PCR indirecte in situ implique l'amplification de l'ADN ou de l'ARN spécifique dans les cellules, suivi d'une hybridation in situ avec des sondes marquées, Améliorer considérablement la spécificité. Cette méthode est actuellement la technologie PCR la plus utilisée in situ.
Différences par rapport à la méthode directe:
- Le système de réaction est le même que la PCR conventionnelle
- Aucune étiquette sur les amorces ou l'adénosine triphosphate utilisée
En PCR indirect in situ, L'amplification est obtenue en premier, suivi de la détection des produits d'ADN spécifiques amplifiés en utilisant des techniques d'hybridation in situ. Cette méthode est également connue sous le nom d'hybridation in situ par PCR (Battre).
Avantages:
- Spécificité plus élevée
- Efficacité d'amplification plus élevée
Désavantage:
- Étapes de fonctionnement plus complexes par rapport à la méthode directe
Technologie de PCR de transcription inverse in situ
PCR de transcription inverse in situ (RT-PCR in situ) est une nouvelle technologie qui applique des techniques RT-PCR en phase liquide aux échantillons de cellules tissulaires. Contrairement à RT-PCR (phase liquide), Avant d'effectuer une PCR à transcription inverse in situ in situ, Les échantillons de tissu sont traités avec de la DNase pour détruire tout ADN présent dans le tissu, Assurer que le modèle d'amplification est une ADNc synthétisée de l'ARNm, Pas l'ADN d'origine dans la cellule. Les autres étapes de base sont similaires au RT-PCR en phase liquide.
Étapes de base
Les étapes de base de la technologie de PCR in situ incluent la préparation des échantillons, amplification in situ (RAP), et détection in situ. Les étapes sont détaillées ci-dessous, en mettant l'accent sur les sections de paraffine comme exemple.
Préparation des échantillons
La technologie de PCR in situ peut être appliquée aux suspensions cellulaires, frottis cellulaires, sections surgelées, et sections de paraffine. Par rapport à d'autres méthodes, effectuer la PCR in situ sur les cellules intactes en suspension donne les meilleurs résultats, tandis que les sections de paraffine donnent le pire. Malgré, Les progrès récents ont signalé une efficacité de PCR satisfaisante dans les sections de paraffine.
Défis:
- Mauvaise conduction thermique et convection de chaleur inégale sur les diapositives
- Adsorption de l'ADN polymérase Taq par les lames de verre
- Manque de membranes cytoplasmiques ou nucléaires intactes conduisant à des produits d'amplification diffus
Fixation:
- Fixation de formol ou de paraformaldéhyde (10% formol tamponné ou 4% paraformaldéhyde) fonctionne bien pour la PCR in situ
- Temps de fixation optimal: 4-6 heures à 4 ° C
Épaisseur de section:
- Des sections plus épais donnent de meilleurs résultats en raison de la teneur en ADN cible plus élevée et plus de structures membranaires, Empêcher la diffusion du produit. Cependant, Des sections plus épais peuvent réduire la qualité et la résolution de l'observation morphologique.
Glissement:
- Empêcher le détachement des tissus pendant la PCR et l'hybridation in situ en traitant des lames avec de la poly-l-lysine ou de la silanisation.
Digestion de la protéinase
Avant l'amplification in situ, Les échantillons de tissu ont besoin d'un traitement protéinase. La digestion de la protéinase augmente la perméabilité cellulaire, Permettre aux composants de réaction de pénétrer dans les cellules et d'exposer des séquences cibles pour l'amplification. Les protéinases couramment utilisées incluent la protéinase k, trypsine, ou pepsine. L'étendue de la digestion doit être ajustée en fonction de la fixation des tissus. Après digestion, Assurer l'inactivation enzymatique par chauffage ou lavage approfondi, Comme les enzymes résiduelles peuvent détruire l'ADN polymérase Taq dans la réaction de PCR.
Pour les avantages et les inconvénients:
- La digestion augmente la perméabilité, Aider les réactions ultérieures
- Il peut également augmenter les risques de diffusion de produit, conduisant à de faux positifs ou négatifs.
Amplification in situ (RAP)
L'amplification in situ fait référence à la réaction de PCR directement sur des échantillons de cellules tissulaires. Son principe de base est entièrement le même que celui de la PCR en phase liquide.
Apprêts
Les amorces utilisées dans PCR sont généralement 15-30 paires de bases (pb) en longueur, Et les fragments amplifiés sont sur 100-1000 pb. Les amorces plus courtes sont préférables pour la PCR in situ. L'ADN extrait des sections de paraffine est rarement terminé 400 pb, Et l'ARN est rarement terminé 200 pb. Les séquences plus longues sont plus sujettes aux décalages entre les amorces et les modèles, conduisant à des réactions non spécifiques.
Système de réaction
Le système de réaction pour la PCR in situ est fondamentalement similaire à la PCR conventionnelle en phase liquide. Cependant, Puisqu'il est effectué sur des sections de tissu fixe, Pour obtenir de meilleurs résultats d'amplification, il est suggéré que les concentrations d'amorces, Taq ADN polymérase, et mg²⁺ dans le système de réaction doivent être plus élevés que ceux de la PCR en phase liquide. Albumine sérique bovine (BSA) doit être ajouté au système de réaction pour empêcher la liaison de l'ADN polymérase Taq à la lame de verre, ce qui pourrait réduire l'efficacité de l'amplification.
Cyclisme thermique
Le cyclisme thermique pour la PCR in situ peut être effectué sur un thermal spécialisé, ce qui est simple à utiliser. Il peut également être fait sur un thermal de PCR général en couvrant la plate-forme d'échantillon avec une couche de papier d'aluminium pour créer une plate-forme, remplir l'espace sur la plate-forme d'échantillon avec de l'huile minérale ou de l'eau, et placer les diapositives sur la plate-forme pour effectuer les étapes de cyclisme thermique.
Pour assurer une amplification suffisante, La durée de chaque étape du processus de cyclisme thermique pour la PCR in situ peut être légèrement plus longue que celle de la PCR conventionnelle. En plus, La méthode de démarrage à chaud peut être utilisée, où la diapositive est chauffée à 80-94 ° C avant d'ajouter immédiatement l'ADN polymérase Taq.
Pour minimiser la perte du système de réaction pendant le processus de cyclisme thermique, vernis à ongles transparent, huile minérale, ou un stylo PAP peut être utilisé pour sceller les bords du glissement de couverture.
Lavage
Après l'amplification in situ, Le spécimen doit être lavé pour éliminer les produits amplifiés qui se sont diffusés à l'extérieur des cellules. Un lavage insuffisant peut entraîner des produits amplifiés visibles pendant la détection, provoquant un fond élevé ou des résultats faux positifs. Cependant, un lavage excessif peut également éluer les produits amplifiés à l'intérieur des cellules, affaiblir ou perdre le signal positif.
Certains auteurs recommandent après la fixation avec 4% paraformaldéhyde pour 2 heures ou 2% glutaraldéhyde pour 5 quelques minutes après l'amplification pour conserver les produits amplifiés dans les cellules pendant la détection, Amélioration de la sensibilité et de la spécificité.
Détection in situ
La méthode de détection des produits d'amplification PCR in situ dépend de la conception de PCR in situ. La méthode directe implique une détection directe in situ en fonction de la nature des molécules marquées. La méthode indirecte nécessite une hybridation in situ pour la détection.
Détection marquée avec de la fluorescéine, biotine, phosphatase alcaline, ou la peroxydase de raifort suit les mêmes principes que les techniques d'immunohistochimie et d'histochimie d'affinité.
Applications de la technologie PCR in situ
L'avantage significatif de la technologie de PCR in situ est sa capacité à détecter des séquences de gènes spécifiques avec des nombres de copies faibles directement dans les cellules tissulaires. En fonction de la nature du gène testé, Les applications de la PCR in situ peuvent être divisées en détection de gènes exogènes et endogènes.
1. Détection de gènes exogènes
(1) Détection de gène viral
Les cellules infectées avec des virus manquent souvent de méthodes de détection efficaces. Cependant, avec l'application de la technologie PCR in situ, Ce problème difficile a une solution prometteuse. Détecter divers virus tels que le VIH, VPH, HSV, VHB, Et le VHC nous permet d'observer ces virus’ rôles dans le sida, tumeurs du système reproducteur, hépatite, et le cancer du foie et pour identifier rapidement les populations infectées.
(2) Détection des gènes bactériens
L'application la plus importante concerne la détection de Mycobacterium tuberculosis. Lorsque les lésions de la tuberculose sont atypiques, Il est difficile de trouver Mycobacterium tuberculosis au microscope en utilisant des méthodes de coloration spéciales. La technologie de PCR in situ peut aider à faire un diagnostic définitif, Même lorsque Mycobacterium tuberculosis est rare.
(3) Détection des gènes introduits
Dans la recherche animale transgénique, confirmant si un gène a été introduit, et chez les patients recevant une thérapie génique, Vérifiez si le gène introduit est présent, Peut être accompli en utilisant la technologie PCR in situ. Ainsi, La PCR in situ est devenue une méthode de détection importante.
2. Détection de gènes endogènes
(1) Détection de gènes anormaux
La technologie de PCR in situ peut détecter les mutations et réarrangements de gènes dans le corps, comme les mutations du gène du proto-oncogène et du suppresseur de tumeur, et immunoglobulines réarrangements du gène de la chaîne lourde dans les lymphomes malins. Cela offre de larges perspectives d'application pour la recherche tumorale et le diagnostic.
(2) Détection de gènes intrinsèques
Pour les gènes intrinsèques à faible exprimé dans les cellules du corps avec une ou quelques copies, La technologie d'hybridation in situ est inefficace en raison du faible numéro de copie de gènes. Tandis que la PCR en phase liquide peut amplifier et détecter ces gènes, il ne peut pas déterminer le type de cellule contenant le gène. La technologie de PCR in situ surmonte les limites de ces deux techniques, nous permettant de détecter divers gènes humains et de compléter la carte des gènes humains.
Hybridation in situ par fluorescence (POISSON)
L'hybridation in situ par fluorescence est une méthode de cartographie physique qui utilise des sondes marquées par fluorescence pour détecter l'hybridation entre la sonde et les chromosomes à la métaphase ou à la chromatine à l'interphase.
Développé à la fin des années 1980, Le poisson est passé d'une technologie d'hybridation in situ radioactive à une technique cytogénétique moléculaire non radioactive en remplaçant le marquage des isotopes par un marquage de fluorescence. En poisson, La sonde est d'abord combinée avec une molécule de journaliste, qui est ensuite lié à un colorant fluorescent par un processus immunocytochimique après l'hybridation.
Le principe de base du poisson est d'étiqueter l'ADN (ou ARN) sondes avec des molécules de nucléotides spéciales, hybrider ces sondes directement sur des chromosomes ou des sections de fibres d'ADN, et utiliser des anticorps monoclonaux couplés à des molécules fluorescentes pour se lier spécifiquement aux molécules de sonde. Cela permet le qualitatif, positionnel, et analyse quantitative relative des séquences d'ADN sur les chromosomes ou les sections de fibres d'ADN.
Le poisson offre une sécurité, vitesse, haute sensibilité, préservation des sondes à long terme, et la capacité d'afficher simultanément plusieurs couleurs. Il peut afficher à la fois des chromosomes de métaphase et des noyaux interphases. En outre, Hybridation in situ par fluorescence multicolore et fluorescence de chromatine Fibrement des techniques d'hybridation in situ ont été développées sur la base du poisson.
Pour ARNr fluorescence in situ hybridation, Plusieurs facteurs peuvent entraîner une faible intensité de signal de fluorescence:
- Faible teneur en ribosomes cellulaires
- Perméabilité à la membrane à faible cellule
- Faible accessibilité de séquence cible en raison du pliage d'ARNr, où certaines positions sont étroitement liées avec d'autres chaînes ou protéines, Empêcher la sonde de s'hybrider avec la séquence cible.
Pour tester si la séquence cible dans les cellules est facilement hybride par la sonde et déterminer la température d'hybridation optimale, “froisser” peut être utilisé: Les gènes d'ARNr sont incorporés dans les plasmides, exprimé en e. coli pour former des ribosomes, puis hybridé avec des sondes marquées par fluorescence.
Le poisson peut également être combiné avec une cytométrie en flux pour compter ou isoler des cellules spécifiquement marquées en fluorescence.
