Kit d'extraction d'ARN super pur (TRIzol)

1. Composants du kit de réactifs

Caractéristiques	50T	100T
Chat. Non.	SN0303	SN0304
Colonnes d'extraction d'ARN (ensemble)	50 (ensemble)	100 (ensemble)
DNase I	1ml	1ml
10 × Tampon de réaction	1 ml	2 ×1ml
Tampon Trizol	50 ml	2 × 50 ml
Tampon d'élimination des inhibiteurs	30 ml	2 × 30 ml
Tampon de lavage 1	15 ml	2 × 15 ml
Tampon d'élution	20 ml	2 ×20ml
Manuel d'instructions	1	1

 

2. Stockage

Ce kit de réactifs doit être conservé à température ambiante (15-25℃) dans un environnement sec et est stable pendant 12 mois. DNase I contient un conservateur, permettant le transport à température ambiante, mais pour un stockage à long terme, il doit être maintenu à -20 ℃.

3. Instructions d'utilisation du kit de réactifs

3.1 Ce kit est destiné à des fins de recherche en biologie moléculaire et ne doit pas être utilisé pour le diagnostic ou le traitement de maladies..

3.2 Certains composants du kit contiennent des irritants; il est conseillé de prendre les précautions nécessaires (comme porter des vêtements de protection et des lunettes).

3.3 L'utilisation de ce kit nécessite un équipement supplémentaire tel qu'une centrifugeuse à grande vitesse, bain d'eau (bain en métal), mélangeur de vortex, éthanol anhydre, l'azote liquide, chloroforme, eau déminéralisée stérile, et tubes EP.

4. Introduction au kit de réactifs

Ce kit de purification d'ARN utilise le TRIzol traditionnel combiné à la méthode de membrane sur colonne pour la purification rapide des plantes., animal, tissu, cellule, ARN microbien, et ARN des hyphes fongiques. Il convient à la plupart des espèces. Ce kit de purification d'ARN peut être appliqué sur des tissus végétaux dépassant 100 mg. L'ARN extrait avec ce kit a une teneur en ADN extrêmement faible. Si la sensibilité à l'ADN dans les expériences est une préoccupation, il est recommandé d'utiliser la digestion DNase I sur la colonne.

Le kit de purification rapide de l'ARN peut extraire l'ARN total des échantillons (y compris l'ARN nucléaire et l'ARN cytoplasmique) dans 1 heure. L'ARN extrait peut être directement utilisé pour la RT-RAP, Transfert du Nord, et d'autres applications.

5. Principes et procédures expérimentaux

6. Processus d'extraction

Précautions avant de commencer l'expérience:

UN. Avant utilisation, ajouter la quantité spécifiée d'éthanol absolu à LaverTampon 1 selon l'étiquette sur le flacon de réactif, et cochez la case sur l'étiquette pour indiquer que de l'éthanol absolu a été ajouté.

B. Le tampon d'élution est un 0.1x solution TE contenant un minimum d'EDTA. Si l'EDTA affecte les expériences ultérieures, il est recommandé de remplacer le tampon d'élution par de l'eau déionisée stérile.

1. Traitement des échantillons:

UN. Tissu: Si des matériaux frais ne peuvent pas être utilisés immédiatement, placez-les dans l'azote liquide et conservez-les à -80°C. Les matériaux séchés peuvent être stockés à température ambiante. Broyer 30 à 80 mg de tissu dans de l'azote liquide et ajouter 1 ml de tampon Trizol pour l'homogénéisation.

B. Cellules cultivées monocouches: Aspirer le milieu de culture et ajouter 1 ml de tampon Trizol pour l'homogénéisation.

C. Suspension cellulaire: Centrifuger pour collecter les cellules et ajouter 1 ml de tampon Trizol pour l'homogénéisation.

2. Après avoir ajouté Tampon Trizol à l'échantillon, bien mélanger en pipetant, permettre une lyse complète de l'échantillon, et incuber à température ambiante pendant 5 minutes.

3. Ajouter du chloroforme dans un rapport de 200 µl par 1 ml de tampon Trizol, secouer vigoureusement pendant 30 secondes, et incuber à température ambiante pendant 2 minutes.

4. Centrifuger le lysat à 4°C, 12,000 tr/min pour 10 minutes. L'ARN sera présent dans la phase aqueuse supérieure.

5. Transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger, éviter la collecte des couches moyennes et inférieures. (Note: Environ 400 μl de liquide peut être transféré, ce qui peut être moindre pour certaines espèces.)

6. Ajouter un volume égal d'éthanol absolu pré-refroidi, mélanger rapidement. (Par exemple, ajouter 400 µl de lysat, ajouter 400 µl d'éthanol absolu. Si le volume du lysat est inférieur à 400 µl, réduire proportionnellement la quantité d'éthanol absolu. Un léger précipité peut se former après l'ajout d'éthanol, mais cela n'affecte pas les expériences ultérieures.)

7. Transférer le liquide obtenu dans une colonne de purification d'ARN (environ 650-700 µl par fois), centrifuger à plus de 8,000 tr/min pour 1 minute, jeter les déchets collectés, et réinsérez le tube de prélèvement dans la colonne de purification pour l'étape suivante.

8. Répétez l'étape 7, ajouter le liquide restant à la colonne de purification d'ARN, centrifuger à plus de 8,000 tr/min pour 1 minute, jeter les déchets et le tube de collecte.

9. Placer la colonne de purification d'ARN dans un nouveau tube de prélèvement, ajouter 300 µl de tampon d’élimination des inhibiteurs, centrifuger à plus de 8,000 tr/min pour 1 minute, jeter les déchets, et réinsérez la colonne de purification d'ARN dans le tube pour l'étape suivante.

10. Ajouter 80 µl de DNase Isolution de travail pour la colonne de purification d'ARN, incuber entre 20°C et 30°C pendant 15 minutes. (Préparer la solution de travail DNase I: 62 µl d'eau sans RNase, 8 μl 10× Tampon de réaction, et 10 µl de DNase I, rattraper 80 µl de solution de travail DNase I.)

11. Ajouter 300 µl de tampon d’élimination des inhibiteursà la colonne de purification d'ARN, centrifuger à plus de 8,000 tr/min pour 1 minute, jeter les déchets, et réinsérez la colonne de purification d'ARN dans le tube pour l'étape suivante.

12. Ajouter 700 µl de tampon de lavage 1à la colonne de purification d'ARN, centrifuger à 14,000 tr/min (20,000×g) pour 2 minutes, prolonger le temps de centrifugation si nécessaire pour une membrane plus sèche. (Note: Confirmez l’ajout d’éthanol au tampon de lavage 1; la présence d'éthanol affecte de manière significative les expériences ultérieures. Assurez-vous que la membrane est sèche après centrifugation avant l’élution. Jeter les déchets et le tube de collecte. Après avoir utilisé le tampon de lavage 1, la membrane de la colonne de purification d'ARN ne doit avoir qu'une légère couleur. Retirez délicatement la colonne de purification d’ARN après centrifugation, s'assurer qu'il ne touche pas le tube de prélèvement pour éviter la contamination par l'éthanol.)

13. Placer la colonne de purification d'ARN dans un nouveau tube à centrifuger, goutte 100 µl de tampon d'élutionsur la membrane, incuber à température ambiante pendant 5 minutes (15°C à 25°C), et centrifuger à plus de 8,000 tr/min pour 1 minute. (Note: Élution de l'ARN avec 50 µl de tampon d'élution peut augmenter la concentration d'ARN mais diminuer le rendement total en ARN.)

14. Répétez l'étape précédente. (Note: Un nouveau tube à centrifuger peut être utilisé pour collecter l'ARN élué la deuxième fois ou continuer à utiliser le tube de collecte d'origine pour collecter l'ARN..)