Solarbio Glutathion réduit (GSH) Kit d'analyse de contenu

Glutathion réduit (GSH) Kit d'analyse de contenu

Note: Prenez deux ou trois échantillons différents pour la prédiction avant le test.

Équipement d'exploitation: Spectrophotomètre/lecteur de microplaques

Numéro de catalogue: BC1175

Taille: 100T/96S

Composants:

Réactif I: 100 mL×1. Conserver à 4℃.

Réactif II: 20 mL×1. Conserver à 4℃.

Réactif III: 8 mL×1. Conserver à 4℃, protéger de la lumière.

Standard: Poudre 10 mg×1. Conserver à 4℃, protéger de la lumière.

Description du produit

Le glutathion est un tripeptide naturel composé d'acide glutamique (Glu), cystéine (Cys) et de la glycine (Gly). C'est une sorte de composé contenant un groupe sulfhydryle (-SH), qui existe largement dans les tissus animaux, tissu végétal, micro-organisme, et de la levure. Le glutathion peut réagir avec 5,5′-dithiobis-(2-acide nitrobenzoïque) (DTNB) pour produire de l'acide 2-nitro-5-mercaptobenzoïque et du disulfure de glutathion (GSSG). 2-L'acide nitro-5-mercaptobenzoïque est un produit jaune, avec une absorption maximale à 412 nm.

Spécifications techniques

Limite minimale de détection：3.763 µg/mL

Plage linéaire：12.5-400 µg/mL

Réactifs et équipements requis mais non fournis

Balance analytique, mortier/homogénéisateur, centrifugeuse basse température, bain d'eau, pipette réglable, spectrophotomètre/lecteur de microplaques, cuvette en micro verre ou 96 puits, plaque à fond plat et eau distillée.

Procédure

je. La préparation des échantillons

1. Échantillon de tissu

Laver les mouchoirs frais avec du PBS deux fois, puis ajouter 0.1 g de tissu animal/végétal dans l'homogénéisateur (l'homogénéisateur a été rincé avec le Réactif I et placé sur la glace avant utilisation). Ajouter 1 mL de réactif I (la proportion de tissus et de réactifs peut être maintenue constante), broyer complètement sur la glace (l'utilisation d'azote liquide aura un meilleur effet de broyage). Centrifuger à 8000 ×g pour 10 minutes à 4℃, prenez le surnageant et placez-le à 4℃ pour le test. (Si le test ne peut pas être effectué temporairement, le surnageant peut être stocké à -80 ℃ pendant 10 jours.)

2. Échantillon de sang

Plasma: L'échantillon est centrifugé à 600 ×g pour 10 minutes à 4℃. Absorber le plasma supérieur dans un autre tube en ajoutant le même volume de réactif I. Centrifuger à 8000 ×g pour 10 minutes à 4℃, prenez le surnageant et placez-le à 4℃ pour le test. (Si le test ne peut pas être effectué temporairement, le surnageant peut être stocké à -80 ℃ pendant 10 jours.)

Cellule sanguine: L'échantillon est centrifugé à 600 ×g pour 10 minutes à 4℃. Jeter le plasma supérieur, laver avec trois fois le volume de PBS pendant 3 fois (remettre en suspension les cellules sanguines avec du PBS, centrifuger à 600 ×g pour 10 minutes), ajouter un volume égal de réactif I. Après avoir mélangé, il est placé à 4℃ pour 10 minutes. Centrifuger à 8000 ×g pour 10 minutes, prenez le surnageant et placez-le à 4℃ pour le test. (Si le test ne peut pas être effectué temporairement, le surnageant peut être stocké à -80 ℃ pendant 10 jours.)

3. Cellule échantillon

La cellule de récolte ne doit pas être inférieure à 106, puis la laver avec du PBS deux fois (remettre en suspension la cellule avec du PBS, centrifuger à 600 ×g pour 10 minutes). Le volume de réactif que j'ai ajouté est trois fois supérieur au volume de précipitation cellulaire pour remettre les cellules en suspension.. Congélation et décongélation répétées 2 à 3 fois (Il est suggéré de congeler dans l'azote liquide, dissous dans un bain-marie à 37 ℃). Centrifuger à 8000 ×g pour 10 minutes, prenez le surnageant et placez-le à 4℃ pour le test. (Si le test ne peut pas être effectué temporairement, le surnageant peut être stocké à -80 ℃ pendant 10 jours.)

II. Procédure

1. Préchauffer le spectrophotomètre/lecteur de microplaques pour 30 minutes, ajuster la longueur d'onde à 412 nm, mettre à zéro avec distillé
2. Préchauffer le réactif II à 37℃ (cellule de mammifère) ou 25 ℃ (autres espèces) bain-marie pour 30
3. Détermination du tube à blanc: prendre une microcuve en verre, ajouter 20 µL d'eau distillée, 140 µL de réactif II, 40 μL de réactif III à son tour, bien mélanger, Lieu pour 2 minutes, et mesurer 412 nm absorbance AB.
4. Faire une courbe standard

Peser 1 mg d'étalon et dissolvez-le avec 1 mL d'eau distillée pour obtenir la concentration de 1 mg/ml. Prendre la solution appropriée pour préparer les étalons avec la concentration de 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL et 12.5 µg/mL (Diluer le réactif I dix fois avant de diluer la solution étalon).

Prends un 1.5 mL de tube EP et ajouter 20 µL d'étalon, 140 μL de réactif II et 40 μL de réactif III à son tour. Après que chaque tube soit uniformément mélangé, il est permis de représenter 2 minutes. Mesurer l'absorbance à 412 nm, et l'absorbance moins AB en abscisse. Faire la courbe étalon en fonction de l'absorbance (X) et concentration (oui, µg/mL).

5. Test en tube d'échantillon: prendre une microcuve en verre, ajouter 20 µL d'échantillon, 140 µL de réactif II, 40 μL de réactif III à son tour, bien mélanger, puis représente 2 minutes pour tester l'absorbance ATat 412 nm, ΔA = AT – UN B.
6. Le fonctionnement du lecteur de microplaques est le même que celui du spectrophotomètre, et l'opération est aussi rapide que

III. Calculs

Selon la courbe standard, prendre l'échantillon ΔA dans la formule(X), et calculer la concentration de l'échantillon y (µg/mL).

• Concentration en protéines

GSH (μg/mg prot)=y×VRV÷VRV÷Cpr =y÷Cpr

• Poids de l'échantillon

GSH (µg/g)=y×VRV÷(VRV÷VSV×W)= y÷W

• Quantité de cellules

GSH (μg/104cellule)=y×VRV÷(VRV÷VSV×N)= y÷N

• Volume de solution GSH (µg/mL)=2 ans

N: Quantité de cellules, 106;

VSV: Volume total de surnageant, 1 ml；

la corde: Volume de surnageant ajouté dans le système réactionnel, 20 µL=0,02 mL； W: Poids de l'échantillon, g;

Cpr: Concentration en protéines du surnageant, mg/ml.

2: Le volume de plasma (cellules sanguines) est dilué une fois.

Note:

1. L'échantillon doit être complètement homogénéisé. Si le test ne peut pas être effectué temporairement, il peut être stocké à-80 ℃.
2. Standard: Le glutathion réduit est préparé lorsque la solution est
3. Si la teneur en GSH de l'échantillon est incertaine, Diluer l'échantillon pour plusieurs gradients avant
4. Parce que le réactif I contient un précipitant de protéines, le surnageant ne peut pas être utilisé pour la détermination de la concentration en protéines. Si la teneur en protéines doit être déterminée, prends un autre mouchoir.

Référence:

• Alpert A J, Gilbert H F. Détection du glutathion oxydé et réduit avec une réaction post-colonne de recyclage[J.]. Biochimie analytique, 1985, 144(2):553-562.
• Owens CWI, Belcher R.V.. Une micro-méthode colorimétrique pour le dosage du glutathion[J.]. Journal biochimique, 1965, 94(3):

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