Ce produit doit être emballé avec des sacs de glace et expédié via FedEx ou UPS.
Présentation du produit：
Ce kit de réactif peut effectuer une détection d'amplification des gènes conservés du virus du polyome aviaire (APV) dans des échantillons tels que oiseau plumes, sang, tissus, Écouvons oraux / génitaux, etc.. En introduisant une référence interne endogène, Le processus d'extraction et d'amplification de l'acide nucléique peut être surveillé pour garantir la précision des résultats du test.
Contenu du produit：
| Composants réactifs | AP2304001-01 （24T） | AP2304001-02 （48T） |
| Solution de réaction APV | 23µL/puits×8puits/bande×3bandes | 23µL/puits × 8 puits/bande × 6 pointes |
| Contrôle positif APV | 100µL | 100µL |
| Contrôle négatif | 100µL | 100µL |
Conditions de stockage：
Conserver à -20℃, la durée de conservation est d'au moins 12 mois
Opération expérimentale：
1. La préparation des échantillons (Zone de préparation des échantillons)
1.1 Exigences relatives aux échantillons：
- Plumes: Recueillir un minimum de 5 plumes de la poitrine, abdomen, ou les jambes (y compris la partie de tige de plume), et n'utilisez pas de plumes naturellement perdues.
- Sang: Utiliser l'EDTA comme anticoagulant, ne pas utiliser l'héparine comme anticoagulant. Du sang total frais doit être utilisé, ou il peut être stocké à 2 ~ 8 ℃ jusqu'à 7 jours, ou stocké à -20 ℃ jusqu'à 3 mois. Évitez autant que possible les congélations et décongélations répétées.
- Tissu: Prenez du tissu musculaire ou organique frais (éviter d'utiliser des échantillons avec de la peau, tendons, ou fascias difficiles à traiter) de pas plus de 100 mg. Préparer l'homogénat de tissus en utilisant 200 à 500 μL d'eau stérile, puis procéder à la préparation ultérieure des échantillons.
1.2 La préparation des échantillons：
- Reportez-vous au manuel du biotechnologie des trois lions “Kit d'extraction rapide d'ADN génomique animal (pour RAP analyse)” (Numéro d'article: DP202), ou d'autres kits/méthodes d'extraction d'acide nucléique qui répondent aux exigences pertinentes, pour l'extraction d'échantillons traités.
- Placez l'échantillon d'acide nucléique extrait dans une glacière et essayez de procéder au test rapidement..
- Il peut être conservé à 4°C jusqu'à 7 jours ou à -20°C jusqu'à 6 mois.
2 . Préparation du système réactionnel (Zone de réaction pour ajouter des échantillons).
2.1 Éliminer les tubes de réaction n + 2 contenant un contrôle positif APV, Contrôle négatif APV, et la solution réactionnelle nécessaire à l'expérience (n représente le nombre d'échantillons à tester, plus 1 contrôle positif, et 1 contrôle négatif). Décongeler complètement les réactifs à température ambiante, centrifugeuse pour 10 secondes, et faites tourner le liquide à l’intérieur des parois et des bouchons du tube jusqu’au fond du tube. Placez-les dans une glacière pour une utilisation ultérieure.
2.2 Alors, ajouter 2μL de contrôle négatif, échantillon d'acide nucléique extrait, et contrôle positif APV à la solution de réaction en séquence. Fermez les bouchons des tubes, faire des enregistrements appropriés, et assurez-vous que le volume total de chaque réaction est de 25 μL. Mélangez soigneusement le contenu, centrifugeuse pour 10 secondes, puis procéder à l'expérience d'amplification sur l'instrument PCR.
3. Amplification PCR (Zone d'amplification et d'analyse de produits).
- Le processus d'amplification PCR est le suivant:
- Pré-dénaturation à 95℃ pour 3 minutes.
- Dénaturation à 95℃ pour 10 secondes.
- Recuit et extension à 60℃ pour 40 secondes, pour un total de 35 cycles.
- Recueillir des signaux de fluorescence à 60 ℃.
- Dans la détection de fluorescence, sélectionnez FAM pour la première chaîne (pour un gène spécifique APV), et sélectionnez VIC/HEX pour le deuxième canal (pour gène de référence endogène).
- Si vous utilisez un instrument de PCR quantitative à fluorescence en temps réel de la série ABI, vous pouvez contacter le fabricant à l'avance ou ajouter vous-même le colorant d'étalonnage ROX si nécessaire; sinon, suivre la procédure normale.
4. Détermination du résultat
4.1
- Si les valeurs Ct du contrôle positif dans le canal FAM et le canal VIC/HEX sont <30 et montre un “S”-courbe d'amplification en forme, et le contrôle négatif n'a pas de valeur Ct ou une valeur Ct ≥35 et aucune “S”-courbe d'amplification en forme, le résultat expérimental est valide.
- Sinon, l'expérience devrait être répétée, et si la répétition de l'expérience est toujours invalide, veuillez contacter le personnel technique.
4.2
- La valeur Ct de l'échantillon dans le canal VIC/HEX doit être ≤32 et montrer un “S”-courbe d'amplification en forme, indiquant que l’extraction et l’amplification de l’échantillon sont efficaces.
- S'il n'y a pas de valeur Ct ou si la valeur Ct est 32 < CT ≤ 35 dans le canal VIC/HEX, cela indique que l'extraction de l'acide nucléique de l'échantillon n'est pas conforme aux normes ou qu'il existe une forte interférence d'inhibition (tels que des résidus d'alcool ou de désinfectants, anticoagulants, etc.) qui inhibe l'amplification.
- Il est recommandé de retraiter l'échantillon pour l'extraction et l'amplification des acides nucléiques..
4.3 Après que la détection dans le canal VIC/HEX soit valide, la détermination dans le canal FAM est effectuée comme suit:
- Valeur CT ≤ 32 Et un “S”-une courbe d'amplification en forme est observée, il est déterminé comme positif à l'APV, indiquant la présence du virus APV dans l'échantillon.
- La valeur Ct est 32 < CT < 35, il est considéré comme suspect, et l'échantillon doit être retesté (en réextrait et en testant l'acide nucléique, il est suggéré d'exclure d'abord “faux positif” résultats causés par une contamination environnementale par aérosols). Si le retest dans le canal FAM après exclusion de la contamination par aérosol montre une valeur Ct < 35 et une courbe d'amplification claire, il est déterminé comme positif à l'APV; sinon, il est déterminé comme négatif.
- Aucune valeur Ct ou valeur Ct ≥ 35 et non “S”-courbe d'amplification en forme, il est déterminé comme négatif pour l'APV, indiquant que le virus APV n'a pas été détecté dans l'échantillon.
Précautions：
- Pour éviter les contaminations, l'expérience doit être menée strictement avec des opérations partitionnées. Il est préférable d'avoir une isolation physique entre les cloisons pour éviter la contamination croisée causée par des facteurs humains. Portez des blouses de laboratoire et des gants en latex pendant l'expérience, et utiliser des outils distincts dans différents domaines. Changer les gants et les blouses de laboratoire au besoin. Après le PCR, n'ouvrez pas les couvercles immédiatement. Attendre un refroidissement suffisant avant d'ouvrir pour l'échantillonnage afin de minimiser la contamination par les aérosols.
- Décongeler complètement les réactifs avant utilisation, mais évitez les congélations et décongélations répétées. Suivez strictement les instructions pour la préparation des réactifs, ajout d'échantillon, et d'autres étapes. L'établi, centrifuger, pipettes, et les autres instruments doivent être régulièrement désinfectés à l'aide de désinfectants contenant du chlore, éthanol, agents d'élimination de la contamination par les acides nucléiques, ou lampes ultraviolettes.
- Un résultat négatif ne signifie pas nécessairement un homme. Mutations inconnues, mauvaise qualité de l'échantillon, faible concentration, ou la présence de substances fortement inhibitrices dans l'extraction de l'acide nucléique (essai) peut également conduire à “négatif” résultats. Ce kit est uniquement utilisé pour l'amplification spécifique du gène CHD-W chez le perroquet. Pour d'autres produits, veuillez consulter le fabricant.
- Ce produit est uniquement pour une utilisation unique. Ne pas congeler et décongeler à plusieurs reprises. Il est uniquement destiné à des fins de recherche scientifique et ne doit pas être utilisé à des fins de diagnostic clinique ou à d'autres fins..
