La extracción de ácido nucleico es una técnica fundamental en biología molecular e investigación genética. El ADN aislado y el ARN de las muestras biológicas proporciona el material de partida para estudiar la expresión génica, detectando patógenos, Análisis de mutaciones, y mucho mas. Sin embargo, Las diferencias importantes entre el ADN y la estructura de ARN y la estabilidad requieren protocolos de extracción especializados optimizados para cada tipo de ácido nucleico.
¿Por qué hacemos Extraer ARN?
El ARN realiza muchos roles importantes en las células. Las principales razones por las que extraemos ARN son:
- Estudiar la expresión génica – La cantidad de ARN producido a partir de diferentes genes proporciona información sobre las actividades celulares.. Analizar los niveles de ARN por cuantitativa PCR o la secuenciación de ARN nos permite comprender los procesos de desarrollo y cómo las células responden a las condiciones cambiantes.
- Para realizar RT-PCR – Extraer ARN permite convertirse en ADNc mediante transcripción inversa. El ADNc se puede usar como plantilla para la amplificación y análisis de PCR.
- Para detección viral – La presencia de ARN viral indica una infección viral activa. Extraer ARN de muestras de pacientes permite el diagnóstico de virus de ARN como la influenza, coronavirus, y retrovirus.
- Experimentos de silenciamiento de genes – La introducción de siRNA o miRNAs sintetizados artificialmente en las células puede degradar los ARNm objetivo, suprimir genes específicos. extracción de ARN Verifica la caída.
- Estructura de ARN y estudios de funciones – Extraer el ARN intacto es necesario para estudiar el plegado de ARN, modificaciones, interacciones, y actividades enzimáticas.
- Perfil de expresión génica – La colección de todos los ARN en una celda es su transcriptoma. El análisis del transcriptoma proporciona información sobre la regulación génica global.
Las diferencias clave entre el ARN y el ADN afectan la extracción
A pesar de ser ambos ácidos nucleicos, El ARN y el ADN tienen distinciones importantes que requieren diferencias en su metodología de extracción:
1. El ARN es químicamente menos estable que el ADN
- El azúcar ribosa en el ARN contiene un grupo hidroxilo (-OH) adjunto en el 2′ posición. Esto hace que la columna vertebral del fosfodiéster sea más propensa a la hidrólisis espontánea.
- El ARN también se degrada fácilmente por la ribonucleasa (ARNasa) enzimas. Las rNasas son estables y difíciles de desnudar, y cantidades muy pequeñas fragmentan ARN.
- En contraste, El ADN carece de los 2′ grupo hidroxilo y no está dirigido por RNasas. Esto hace que el ADN sea más estable que el ARN químicamente.
2. El pH óptimo para la extracción difiere
- El ADN es más estable durante la extracción a un pH neutral o ligeramente alcalino de 7-8.
- Sin embargo, un ph arriba 7 Promueve la hidrólisis alcalina de ARN debido a la ribosa 2′-OH. Condiciones ácidas por debajo del pH 5 son necesarios para el ARN.
- Esta diferencia en el pH óptimo presenta un desafío clave al extraer simultáneamente.
3. Abundancia celular y requisitos de muestra
- Muchas copias del ADN genómico están presentes dentro de cada célula., Permitir que las cantidades de micrograma sean fácilmente aisladas.
- El conjunto de diferentes tipos de ARN extraídos depende de los niveles de expresión específicos del tejido. Las cantidades de nanograma se obtienen típicamente.
- De este modo, El ARN requiere un manejo y optimización más cuidadosos para extraer las cantidades minuciosas presentes intactos.
Comparación paso a paso de los protocolos de extracción de ARN y ADN
Con esas diferencias clave en mente, Examinemos los enfoques especializados tomados en cada paso de ARN y extracción de ADN:
1. Interrupción de la muestra y homogeneización
- Tanto para ADN como para ARN, La lisis celular se requiere primero para interrumpir las membranas y liberar ácidos nucleicos. Los métodos incluyen la interrupción física al moler las muestras de tejido congelado.
- Sin embargo, Los inhibidores de la ARNasa deben agregarse inmediatamente a las muestras de ARN durante este paso para inactivar las abundantes ribonucleasas liberadas. No se usa inhibidor para el ADN.
2. Separación de ácidos nucleicos de componentes celulares
- Para la extracción de ADN, Agregar soluciones salinas concentradas provoca la precipitación de proteínas mientras deja el ADN solubilizado.
- Para ARN, sales caotrópicas como concentradas isotiocianato de guanidinio Proteínas de desnaturalización rápidamente al tiempo que inactivan las RNasas.
- La extracción orgánica con fenol y cloroformo ayuda a separar los ácidos nucleicos liberados de las proteínas, lípidos, y carbohidratos para ADN y ARN.
3. Precipitación y recuperación de ácidos nucleicos
- La precipitación de etanol o isopropanol aísla el ADN o el ARN de las soluciones acuosas. Las condiciones ligeramente saladas mejoran la eficiencia de la precipitación de ARN.
- Debido a las cantidades de ARN diminutas, Los coprecipitantes como el glucógeno o la acrilamida lineal se usan para pellets ARN visualmente.
- El ADN de alto peso molecular precipita fácilmente mientras el ARN permanece solubilizado en etanol en condiciones de tampón específicas. Esto permite su separación.
4. Eliminar contaminantes
- Las preparaciones de ADN se tratan con RNasa para eliminar los fragmentos de ARN co-purificados.
- Asimismo, La digestión de DNasa sin ARNasa elimina el ADN traza de los extractos de ARN.
- Se puede hacer una purificación adicional utilizando columnas de spin, extracciones de fenol, o pasos de precipitación para eliminar las sales, enzimas, carbohidratos, y otros contaminantes.
Evaluar la cantidad, Pureza, e integridad
El control de calidad riguroso es necesario para garantizar que el ADN y el ARN extraídos sean adecuados para técnicas analíticas sensibles:
Cuantificación de niveles de ácido nucleico
- Absorción UV en 260 NM utilizando una concentración de estimaciones de espectrofotómetro a través de la ley de Beer-Lambert.
- Cuantificación fluorométrica con tintes como SIBR Verde I es más sensible y preciso que la absorbancia UV.
Evaluación de la pureza
- La relación A260/A280 detecta la contaminación de proteínas o fenol. El ADN puro/ARN tiene relaciones alrededor 1.8.
- Relaciones adicionales de longitud de onda como A260/A230 pueden detectar polisacárido o contaminación caotrópica.
Evaluar la integridad de ARN
- La electroforesis revela si el ARN está intacto o degradado. Las bandas de ARN ribosómicas de 28S y 18S representan ARN intacto.
- El número de integridad de ARN (Rin) El algoritmo obtiene objetivamente la calidad de ARN de los electroferogramas.
- El ARN degradado aparece como frotis en lugar de bandas discretas y no es adecuado para los ensayos aguas abajo.
Conclusión
Mientras que las extracciones de ADN y ARN comparten algunos principios comunes, El ARN es más propenso a la degradación y requiere pasos específicos para aislarlo intacto. Comprender estas diferencias clave permite a los investigadores obtener ácidos nucleicos de alta calidad para aplicaciones sensibles aguas abajo. Con práctica, Los protocolos de extracción se pueden ajustar para un ARN óptimo y purificación de ADN de diversas fuentes biológicas.
Preguntas frecuentes
¿Por qué es necesario un inhibidor de RNasa??
Las RNasas degradan rápidamente el ARN durante la extracción. Los inhibidores de la RNasa se unen e inactivan irreversiblemente estas enzimas, Preservar ARN intacto.
¿Cuáles son los mejores tejidos para extraer ARN de?
El ARN es abundante en tejidos metabólicamente activos como el hígado, riñones, o dividir activamente las células. Estos proporcionan altos rendimientos. Los tejidos con altos niveles de ARNasa como el páncreas o la piel son más desafiantes.
¿Cuánto tiempo se puede almacenar el ARN después de la extracción??
El ARN aislado debe almacenarse a -80 ° C en agua libre de nucleasas. En condiciones ideales, El ARN puede permanecer intacto durante un año, pero todavía se produce cierta degradación con el tiempo.
¿La elección del kit de extracción hace la diferencia??
Sí, Los componentes del kit, como los tampones de lisis y los inhibidores de la ARNasa, afectan la calidad del ARN. Ciertos kits funcionan mejor para aplicaciones específicas como QPCR o secuenciación de ARN.
