Solarbio Succinato Deshidrogenasa (SDH) Kit de ensayo de actividad

Succinato Deshidrogenasa (SDH) Kit de ensayo de actividad

Nota: Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba..

Equipo de detección: espectrofotómetro

No gato: BC0950

Tamaño: 50T/48S

Componentes

reactivo yo: 60 mL×1, almacenar a -20 ℃. Reactivo II: 0.6 mL×1, almacenar a -20 ℃. Reactivo III: 5 mL×1, almacenar a las 4 ℃.

Reactivo IV: Polvo × 1, almacenar a las 4 ℃. Cuando se usará la solución, agrégalo al reactivo III para disolver para usar.

Reactivo V: Polvo × 1, almacenar a las 4 ℃. Agregar 4 mL de agua destilada cuando se utilizará la solución., Los reactivos no utilizados se almacenan a 4 ℃.

Reactivo VI: Polvo × 1, almacenar a -20 ℃. Agregar 3.333 mL de agua destilada cuando se utilizará la solución., Los reactivos no utilizados se almacenan a 4 ℃.

Descripción

Succinato Deshidrogenasa (SDH, CE 1.3.5.1) se encuentra ampliamente en animales, plantas, microorganismos y células cultivadas. SDH es una enzima marcadora de mitocondrias, que es una enzima de unión a la membrana ubicada en la membrana interna de las mitocondrias. También es uno de los puntos clave de la transferencia de electrones respiratorios y la fosforilación oxidativa. Además, Proporciona electrones para la cadena respiratoria de varias células procariotas..

SDH puede catalizar la deshidrogenación del ácido succínico al ácido fumárico. La deshidrogenación puede reducir el 2,6-diclorofenol con nicófenol (Dcpip) bajo la transferencia de fenazina dimetil sulfato (PMS). 2,6- DCPIP tiene un pico de absorción característico en 600 Nuevo Méjico. La tasa de reducción de 2,6-DCPIP está determinada por el cambio de absorbancia en 600 Nuevo Méjico, que representa la actividad de la enzima SDH.

Requerido pero no proporcionado

espectrofotómetro, baño de agua, centrífuga de mesa, pipeta ajustable, mortero/homogeneizador, 1 cubeta de vidrio de ml, hielo y agua destilada.

Protocolo

I. Extracción de SDH:

Pesar con precisión 0.1 g de tejido o recolección 5 millones de células, agregar 1 ml de reactivo I y 10 µL de Reactivo II, homogeneizar utilizando homogeneizador/mortero en baño de hielo, moler completamente, centrifugar en 11000 ×g para 10 minutos a las 4 ℃, Tome el sobrenadante y colóquelo en hielo para probar.

II. Procedimiento

1. Precalentar el espectrofotómetro para 30 minutos, ajustar la longitud de onda a 600 nm y set cero con agua destilada.
2. Prueba de procedimiento

Agregar cada reactivo a 1 Ml cubeta de vidrio a su vez, y comience a cronometrar al mismo tiempo de agregar reactivo VI, Registre la absorbancia inicial A1 en la longitud de onda de 600 nm para 20 segundos. Luego coloque la cubeta junto con la solución de reacción en un baño de agua de 37 ℃ (mamífero) o 25 ℃ (otras especies), y reacción precisa para 1 minuto. Rápidamente saca la cubeta y secala, y registrar la absorbancia A2 en 80 segundos en 600 Nuevo Méjico. ΔA = A1-A2, obtener Δat, ΔAB.

III. Cálculo de SDH actividad

Fórmula de cálculo para determinar con 1 cubeta de vidrio de ml.

• Concentración de proteínas

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza el consumido de 1 NMOL de 2,6-diclorofenol de nicófenol por minuto en el sistema de reacción cada proteína de tejido miligramo.

SDH(Prot. U/mg)＝[(Δat-ΔAb)÷(ε×d)× VRV × 109]÷(CPR × VS) ÷ t ＝ 1555.556 ×(Δat-ΔAb)÷Cpr

• Peso de la muestra

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza el consumido de 1 NMOL de 2,6-diclorofenol de indofenol por minuto en el sistema de reacción cada tejido de gramo.

SDH(u/g)＝[(Δat-ΔAb)÷(ε×d)× VRV × 109]÷(VS ÷ VST × W) ÷ T ＝ 1571.111 ×(Δat-ΔAb)÷W

• Germen o células

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza el consumido de 1 nmol de 2,6-diclorofenol de indofenol por minuto en el sistema de reacción cada 10 Mil gérmenes o células.

SDH(celda U/104)＝[(Δat-ΔAb)÷(ε×d)× VRV × 109]÷(VS ÷ VST × 500) ÷ t

＝ 3.142 ×(Δat-ΔAb)

VRT: Volumen total de reacción, 0.98× 10-3 L;

mi: El coeficiente de extinción molar de 2,6-DCPIP, 2.1× 104 l/mol/cm; d: El diámetro de la luz de la cubeta, 1 cm;

contra: Volumen de la muestra, 0.03 mililitros;

VST: Agregue el volumen de reactivo I y reactivo II, 1.01 mililitros; t: Tiempo de reacción(mín.), 1 minuto;

RCP: Concentración de proteína de muestra, mg/mL; W.: Peso de la muestra, gramo;

500: Células o germen, 5 millón.

Nota

1. Todos los reactivos y muestras se colocarán en hielo durante la determinación para evitar la desnaturalización y la desactivación.
2. Si ΔA es mayor que 0.5, La solución enzimática debe diluirse con extracto de enzima para obtener ΔA con menor que 0.5, que puede mejorar la sensibilidad de detección.
3. Porque la solución de extracto contiene una cierta concentración de proteína (acerca de 1 mg/mL), Es necesario restar el contenido de proteína de la solución de extracto en sí mismo al determinar la concentración de proteína de la muestra.

Ejemplo experimental:

1. Tomar 0.1g de riñón, agregar 1 ml de reactivo ⅰ y 10 μL Reactivo ⅱ, Muela el homogeneizado con baño de hielo, centrífuga a 4 ℃ y 11000 g para 10 mín., y colocar el sobrenadante en el hielo. De acuerdo con el procedimiento de determinación, La actividad enzimática se calcula de la siguiente manera: ΔAT = A1T- A2T = 0.82-0.681 = 0.139, ΔAB= A1B- A2B = 905-0.904 = 0.001

Actividad SDH (masa U/g) = 961.905 ×(Δat- ΔAB) ÷ w = 2168.13 U/g de masa.

Referencias

• Hechos P, Bertoni-Foldari C, Cajas u, et al. Actividad de deshidrogenasa succínica deteriorada de las mitocondrias de las células purkinje de rata durante el envejecimiento[j]. Mecanismos de envejecimiento y desarrollo, 1998, 101(1-2): 175- 182.

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