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Solarbio Ribulosa 1 5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (Rubisco) Kit de ensayo

Name: Solarbio Ribulose 1 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) Assay Kit
Availability: InStock

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Métodos de pago: PayPal seguro o tarjeta de crédito.

Descripción

Nota: Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba..

Equipo de operación: espectrofotómetro

No gato: BC0440

Tamaño:50T/48S

Componentes:

Reactivo	Especificación	Condiciones de almacenaje	Preparación antes de usar
Extraer solución	50 mililitros × 1	4℃	–
reactivo yo	50 mililitros × 1	4℃	–
Reactivo II	Polvo × 1	-20℃	–
Reactivo III	Polvo × 2	-20℃	disolver con 1 ml de agua destilada antes de usar; Si aparece la turbidez después de la oscilación, centrífuga antes de usar.
Reactivo IV	Polvo × 1	-20℃	disolver con 2 ml de agua destilada antes de usar.
Solución de trabajo	–	–	Agregue todo el reactivo I al reactivo II antes de usar, mezclar bien, e incubar a 25 ℃ para 5 minutos.

Descripción del Producto:

Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (Rubisco) es una enzima clave en la fotosíntesis de la planta.
Controla la fijación de dióxido de carbono y regula el flujo de carbono al ciclo de Calvin y al ciclo de fotorrespiración.
La actividad de Rubisco influye directamente en la tasa fotosintética.
Rubisco cataliza la combinación de ribulosa-1,5-difosfato (Ruina) y dióxido de carbono para producir 3-fosfoglicerato (PGA).
PGA se convierte aún más en gliceraldehído-3-fosfato, acompañado de oxidación de NADH para formar NAD+.
Nadh absorbe la luz en 340 Nuevo Méjico, Mientras que Nad+ no.
en este equipo, La actividad de Rubisco se determina midiendo la disminución de la absorbancia de NADH en 340 Nuevo Méjico.

Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados:

Espectrofotómetro ultravioleta, centrífuga de escritorio, pipeta ajustable, baño de agua, 1 cubeta de cuarzo ml, mortero/homogeneizador, hielo, agua destilada.

Procedimiento:

Preparación de la muestra:

- Bacterias o células:
  - Recolecte bacterias o células en un tubo de centrífuga y una centrífuga para descartar el sobrenadante.
  - Agregar 1 mL de solución de extracto para 5 millones de bacterias o células.
  - Use la ultrasonicación (con hielo, 20% fuerza, 3 segundos en, 10 segundos apagados, repetido 30 veces) a las bacterias o células de Lyse.
  - Centrifugar en 10000 ×g para 10 minutos a 4 ° C para eliminar materiales insolubles y recolectar el sobrenadante en hielo para probar.
- Tejido:
  - Agregar 1 mL de solución de extracto para 0.1 g de tejido (Preferiblemente muestras de plantas frescas) y homogeneizar sobre hielo.
  - Centrifugar en 10000 ×g para 10 minutos a 4 ° C para eliminar materiales insolubles, y recolectar el sobrenadante en hielo para realizar pruebas.

Procedimiento de determinación:

- - - Precaliente el espectrofotómetro UV para 30 minutos y ajustar la longitud de onda a 340 Nuevo Méjico. Cero el instrumento con agua destilada.
    - Agregue los siguientes reactivos:

Reactivo (µL)	Tubo de ensayo (t)	tubo en blanco (B)
Muestra	100	–
agua destilada	–	100
Reactivo III	35	35
Reactivo IV	35	35
Solución de trabajo	900	900

Detectar la absorbancia en 340 nm en el momento de los 20 y 5min20s, registrar como A1 y A2 respectivamente. ΔA(t)= A2(t)-A1(t), ΔA(B)= A2(B)-A1(B), ΔA = ΔA(t)-ΔA(B). Mantenido a 25 ℃ durante la reacción. Los tubos en blanco solo necesitan ser probados una o dos veces.

Cálculo:

Concentración de proteínas:

- Definición de unidades: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la producción de 1 nmol de NADH por minuto por cada miligramo de proteína.
- Rubisco (Prot. U/mg) Cálculo:
  - Rubisco(Prot. U/mg) = [ΔA ÷ (ε×d) × 10^9 × cuerda] ÷ (VS × CPR) ÷ t
  - Rubisco(Prot. U/mg) = 344 × ΔA ÷ CPR

Peso de muestra:

- Definición de unidades: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la producción de 1 nmol de nadh por minuto por cada gramo de tejido.
- Rubisco (Peso U/g) Cálculo:
  - Rubisco(Peso U/g) = [ΔA ÷ (ε×d) × 10^9 × cuerda] ÷ (W ÷ ve × vs) ÷ t
  - Rubisco(Peso U/g) = 344 × ΔA ÷ en

Bacterias o células cultivadas:

- Definición de unidades: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la producción de 1 nmol de nadh por minuto por cada 10,000 células o bacterias.
- Rubisco (U/10^4 celda) Cálculo:
  - Rubisco(U/10^4 celda) = [ΔA ÷ (ε×d) × 10^9 × cuerda] ÷ (VS ÷ VE × 500) ÷ t
  - Rubisco(U/10^4 celda) = 0.69 × ΔA

Constantes y parámetros:

mi: Coeficiente de extinción molar NADH, 6.22 × 10^3 l/mol/cm
d: Camino de luz de la cubeta, 1 cm
Soga: Volumen total de reacción, 1.07 × 10^-3 L
contra: Volumen sobrenadante, 0.1 mililitros
ve: Solución de extracción Volumen agregado, 1 mililitros
RCP: Concentración de proteína de muestra (mg/mL)
t: Tiempo de reacción, 5 minutos
W.: Peso de la muestra (gramo)
500: 5 Millones de células o bacterias.
10^9: 1 mol = 10^9 nmol

Ejemplo experimental:

Tomar 0.1 g de hojas de plantas, agregar 1 ml de solución de extracto para homogeneización, tomar el sobrenadante, y luego operar de acuerdo con los pasos de determinación.

Medir con cubeta de micro cuarzo y calcular

ΔAT = AT1-AT2 = 1.279-1.206 = 0.073, ΔAb = AB1-AB2 = 0.834-0.823 = 0.011,

ΔA = ΔAT -ΔAB = 0.073-0.011 = 0.062

Actividad de Rubisco (masa U/g) = 344 × ΔA ÷ W = 344 × 0.062 ÷ 0.1 = 213.28 U/g de masa.

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Información adicional

tamaño	25t, 50t

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