Solarbio fosfoenolpiruvato carboxyinasa (Pepck) Kit de ensayo de actividad

Componentes:

Extraer solución: 60 ml × 1. Almacenamiento a 4 ℃.

reactivo yo: 45 mL×1, almacenado a las 4 ℃.

Reactivo II: polvo × 1, almacenado a -20 ℃ y protegido de la luz. Disolverlo en 35 ml de reactivo I antes de usar. El reactivo que no se puede usar se almacenará a -20 ℃ después de volver a empaquetar, Repita el congelamiento y la descongelación están prohibidos;

Reactivo III: 45 µL×1, almacenado a 4 ℃ y protegido de la luz. Antes de uso temporal, Agregar agua destilada a diluir según la relación de volumen de 1:120, para prepararse cuando se utilizará la solución.

Reactivo IV: 155 µL×1, almacenado a 4 ℃ y protegido de la luz. Antes de uso temporal, Agregar agua destilada a diluir según la relación de volumen de 7:250, para prepararse cuando se utilizará la solución.

Reactivo V: Polvo × 1, almacenado a -20 ℃ y protegido de la luz. Disolverlo en 2.5 ml de agua destilada antes de usar, El reactivo que no se puede usar se almacenará a -20 ℃ después de volver a empaquetar, Repita el congelamiento y la descongelación están prohibidos;

Descripción del Producto:

Pepck (CE 4.1.1.32) se encuentra ampliamente en animales, plantas con flores, algas, algunos hongos, y bacterias. La enzima cataliza la conversión de ácido oxaloacético a fosfoenolpiruvato, que es la enzima limitante de primer nivel que regule la gluconeogénesis.

Pepck cataliza el ácido oxaloacético para formar fosfoenolpiruvato y CO2, La piruvato quinasa y la lactato deshidrogenasa catalizan aún más la oxidación de NADH a NAD+ a su vez, y determinar la tasa de disminución de NADH en 340 Nuevo Méjico, que puede reflejar la actividad de Pepck.

Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados

espectrofotómetro, centrífuga de baja temperatura, bote de agua, 1 cubeta de cuarzo ml, pipeta ajustable, mortero/homogeneizador, hielo y agua destilada

Procedimiento

I. Extracción de la solución enzimática cruda:

1. 1. Muestra de tejido:

La proporción de masa de tejido (gramo): Volumen de solución de extracto (mililitros): 1:5~10 (se recomienda pesar sobre 0.1 g de tejido, agregar 1 ml de solución de extracto) para el baño de hielo homogeneizado, luego centrifugado en 8000 ×g para 10 minutos a las 4 ℃, Tome el sobrenadante y colóquelo en hielo para probar.

2. Bacterias o células cultivadas.:

Primero, Recoge bacterias o células en el tubo de centrífuga, y luego descarte el sobrenadante. El número de celdas (104): el volumen del extracto (mililitros) es 500-1000:1 (1 Se recomienda agregar ml de la solución de extracto a 5 millones de bacterias o células), y las células se rompen por onda ultrasónica en baño de hielo (Fuerza: 200W o 20%, ultrasónico:3s, intervalo:10s, Repetir 30 veces). Luego centrifugado en 8000 ×g para 10 minutos a las 4 ℃, Tome el sobrenadante y colóquelo en hielo para probar.

3. muestra de suero: Determinación directa.

II. Prueba procedimiento:

1. Precaliente el espectrofotómetro por más de 30 minutos, ajustar la longitud de onda a 340 Nuevo Méjico, y ajuste a cero con destilado
2. Solución de trabajo: Mezclar reactivo II, Reactivo III, Reactivo IV en la proporción de 7:1:1(V:V:V) antes de usar. Prepárese cuando se use la solución.
3. Precaliente la solución de trabajo a 37 ℃ (mamífero) o 25 ℃ (otras especies) para 5 minutos.
4. mesa de operaciones: Agregue los siguientes reactivos al 1 Ml Cuvette de cuarzo a su vez:

III. Cálculo de Pepck:

1. Cálculo de Micro Quartz Cuvette

• Calculado por concentración de proteína tisular:

Definición de actividad enzimática: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza el consumo de 1 nmol de nadh por minuto, cada miligramo de proteína.

Actividad de Pepck (Prot. U/mg) = ΔA ÷(ε×d)× VRT × 109 ÷ (VS × CPR) ÷ t = 3215.4 × ΔA ÷ CPR

• Calculado por la calidad de las muestras de tejido:

Definición de actividad enzimática: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza el consumo de 1 nmol de nadh por minuto, cada gramo de muestra.

Actividad de Pepck (U/g peso fresco) = ΔA ÷(ε×d)× VRT × 109 ÷ (VS ÷ VST × W) ÷ t = 3215.4 × ΔA ÷ W

• Por recuento de células:

Definición de actividad enzimática: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza el consumo de 1 nmol de nadh por minuto cada 10 mil células

Actividad de Pepck (celda U/104)=ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS ÷ VST × 500)÷ t = 6.43 × ΔA

• Calculado por volumen sérico:

Definición de actividad enzimática: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza el consumo de 1 nmol de nadh por minuto cada mililitro de suero

Actividad de Pepck (unidades/mL) = ΔA ÷(ε×d)× VRV × 109 ÷ vs ÷ t = 3215.4 × ΔA

mi: Coeficiente de extinción molar de NADH, 6.22×103 L/mol/cm; d: Diámetro de luz de la cubeta, 1 cm;

VRT: Volumen total del sistema de reacción, 0.001 l;

contra: El volumen de muestra en el sistema de reacción, 0.05 mililitros; VST: El volumen de la solución de extracto, 1 mililitros;

RCP: Concentración de proteína de muestra, mg/mL, Autodeterminación de la concentración de proteínas; W.: La masa de masa de muestra, gramo;

t: Tiempo de reacción, 1 minutos;

500: Número total de bacterias o células., 5 millón; 109: Factor de conversión de unidades, 1 moles = 109 nmol.

Nota:

1. Cuando A1 es menor que 1 o ΔA es mayor que 0.6, Se recomienda diluir la muestra a un múltiplo adecuado antes de la determinación para mejorar la detección
2. Para muestras con alta actividad enzimática, como el hígado animal, riñón y otros tejidos, se recomienda diluir el extracto a 5 veces o más para
3. El tubo en blanco es un pozo de prueba para probar la calidad de cada componente de reactivo. En condiciones normales, el cambio no excede 06.
4. Los pasos de suma de muestra y mezcla serán rápidos, y la sincronización del cronómetro será precisa. Si las condiciones lo permiten, se recomienda que dos personas cooperen para completar esto

Ejemplo experimental:

1. Tome 0.1g de hígado y agregue 1 Solución de extracto de ml para homogeneizado. Tome el sobrenadante y diluya dos veces con la solución de extracto. Luego opere de acuerdo con los pasos de determinación. Medir y calcular: Δat = a1d- A2D = 1.175-0.532 = 0.643, ΔAB= A1B – A2B = 1.29-1.244 = 0.046, ΔA = ΔAT – ΔAB = 0.643-0.046 = 0.597

Actividad de Pepck (masa U/g) = 3215.4 × ΔA ÷ W × 10 (relación de dilución) = 3215.4 × 0.597 ÷ 0.1 × 10 = 191959.4 U/g de masa.

2. Tome 0.1g de aloe vera y agregue 1 Solución de extracto de ML para homogeneización, Tome el sobrenadante y opere de acuerdo con los pasos de determinación. Medir y calcular Δat = a1t- A2T = 1.257-1.106 = 0.151, ΔAB= A1B- A2B = 1.29-1.244 = 0.046, ΔA = ΔAT – ΔAb = 0.151-0.046 = 0.105

Actividad de Pepck (masa U/g) = 3215.4 × ΔA ÷ W = 3215.4 × 0.105 ÷ 0.1 = 3376.17 U/g de masa.

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