peroxidasa (VAINA) Kit de ensayo de actividad

Nota: Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba..

Equipo de operación: espectrofotómetro Numero de catalogo: BC0090 Tallas：50T/48S

Componentes:

Extraer solución: 60 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

reactivo yo: 40 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Reactivo II: 0.5 ml × 1. Almacenamiento a 4 ℃. Centrífuga antes de usar. Llevar 0.22 ml de reactivo II y agregar 3.33 ml de reactivo I, Mezclarlo para su uso posterior (Alrededor de 27T). Prepárelo para uso inmediato, o se puede preparar en proporción de acuerdo con el volumen de la muestra.

Reactivo III: 10 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Descripción del Producto

peroxidasa (VAINA, CE 1.11.1.7) Existe ampliamente en animales, plantas, y microorganismos. Puede catalizar la oxidación de fenoles y aminas por peróxido de hidrógeno, y tiene el doble efecto de eliminar la toxicidad del peróxido de hidrógeno, fenoles, y aminas. En presencia de peróxido de hidrógeno, POD CAN cataliza H2O2 oxidar sustratos específicos para producir una sustancia que tenga una absorción a 470 Nuevo Méjico.

Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados

espectrofotómetro, centrífuga de escritorio, transferidor, 1 cubeta de vidrio de ml, mortero/homogeneizador, hielo y agua destilada.

Procedimiento

I. preparación de la muestra:

A. Bacterias o células

Recoger bacterias o células en el tubo de centrífuga., El sobrenadante se descarta después de la centrifugación. Se sugiere que se tome 5 millones de bacterias/células y agregar 1 mL de solución de extracto. Las bacterias o la célula se dividen por ultrasonicación (Fuerza: 20% o 200 W., tiempo de trabajo 3s, intervalo 10s, repetir para 30 veces). Centrifugar en 8000 RPM y 4 ℃ para 10 minutos, El sobrenadante se usa para la prueba.

B. Tejido

Se recomienda tomar 0.1 g de tejido y agregar 1 mL de solución de extracto, moliendo completamente sobre hielo.

Centrifugar en 8000 rpm para 10 minutos a las 4 ℃, El sobrenadante se usa para la prueba.

C. Suero (plasma) muestra: Detectar muestra

II. Determinación procedimiento

1. Precalentar el espectrofotómetro para 30 minutos, ajustar la longitud de onda a 470 Nuevo Méjico, poner a cero con destilado
2. Coloque el reactivo I, Reactivo II y Reactivo III a 37 ℃ (mamífero) o 25 ℃(otras especies) para 10 minutos antes
3. Agregue reactivos con la siguiente lista:

Nombre de reactivo (µL)	Tubo de ensayo
Muestra	15
Agua destilada	270
reactivo yo	520
Reactivo II	130
Reactivo III	135

Los reactivos anteriores se agregan a 1 Ml cubeta de vidrio en secuencia, inmediatamente mezclado y cronometrado. Los valores de absorbancia A1 para 30 S y A2 para los 90 en 470 nm se registran, ΔA ＝ A2-A1.

III. Cálculos

I. Suero (plasma)muestra

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la absorbancia de 0.01 cambiar 470 nm en el sistema de reacción por minuto cada mililitro de suero (plasma).

VAINA(unidades/mL)=ΔA×Vrv÷Vsv÷0.01÷T =7133×ΔA

II. Tejido, bacterias o células de cultivo

A. Concentración de proteínas

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la absorbancia de 0.01 cambiar 470 nm en el sistema de reacción por minuto cada miligramo de proteína.

VAINA(Prot. U/mg)＝ΔA×Vrv÷(Vsv×Cpr)÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr

B. Peso de la muestra

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la absorbancia de 0.01 cambiar 470 nm en el sistema de reacción por minuto cada gramo de tejido.

VAINA(U/g peso fresco)＝ΔA×Vrv÷(W× Vsv÷Vs)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W

C. cantidad de celda

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la absorbancia de 0.01 cambiar 470 nm en el sistema de reacción por minuto cada 10 mil bacterias o células.

VAINA(celda U/104)＝ΔA×Vrv÷(500×Vsv÷Vs)÷0,01÷T =14,27×ΔA

Soga: Volumen total de reacción, 1.07 mililitros; vsv: Volumen total de sobrenadante, 0.015 mililitros; contra: Volumen de solución de extracción, 1 mililitros;

t: Tiempo de reacción, 1 minuto;

RCP: Concentración de proteína de muestra, mg/mL; W.: Peso de la muestra, gramo;

500: Número total de bacterias o células., 5 millón.

Nota:

1. Si hay muchas muestras para determinar al mismo tiempo, la mezcla del Reactivo I, II, III y agua destilada se pueden preparar en proporción, y la mezcla se puede colocar a 37 ℃ (mamífero) o 25 ℃ (otras especies) Por más de 10 minutos. 15 µL de muestra y 1055 Se pueden agregar μL de mezcla para su determinación..
2. Si ΔA es menor que 0.005, El tiempo de reacción se puede extender a 5 minutos. Si ΔA es mayor que 0.5 o hay más burbujas en la solución de reacción, la muestra se puede diluir con el extracto y determinar, y la fórmula de cálculo se multiplica por la dilución correspondiente.
   

   Referencias

   • Reuveni R . Actividad peroxidasa como marcador bioquímico de resistencia del melón ( melón pepino ) a Pseudoperonospora cubensis[j]. Fitopatología, 1992,82(7).
   • Doerge D R , Divi R L , Churchwell MI . Identificación del producto de oxidación del guaiacol coloreado producido por peroxidasas[j]. Bioquímica analítica, 1997,250(1):10-17.

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