Creatina Quinasa Solarbio (CK) Kit de ensayo de actividad

Creatina quinasa (CK) Kit de ensayo de actividad

Nota: Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba..

Equipo de operación: espectrofotómetro

No gato: BC1140

Tamaño:50T/48S

Componentes:

Extraer solución: 60 ml × 1. Almacenamiento a 4 ℃.

reactivo yo: polvo × 1, almacenado en la oscuridad a -20 ℃. Disuelto en 10 ml de agua destilada antes de usar, El reactivo no utilizado se almacenará a -20 ℃ después de reempaquetarse, Se prohíben la congelación y descongelación repetidas.

Reactivo II: polvo × 1, almacenado a -20 ℃. Disuelto en 0.5 ml de agua destilada antes de usar, El reactivo no utilizado se almacenará a -20 ℃ después de reempaquetarse, Se prohíben la congelación y descongelación repetidas.

Reactivo III: polvo × 2, almacenado a -20 ℃. Disuelto en 0.5 ml de agua destilada antes de usar, Los reactivos que no se pueden usar se almacenarán a -20 ℃ después de volver a empaquetar, Se prohíben la congelación y descongelación repetidas.

Reactivo IV: polvo × 1, almacenado a -20 ℃. Disuelto en 0.65 ml de agua destilada antes de usar, El reactivo no utilizado se almacenará a -20 ℃ después de reempaquetarse, Se prohíben la congelación y descongelación repetidas.

Reactivo V: 15 ml × 1. Almacenamiento a 4 ℃.

 

Descripción del Producto:

Creatina quinasa (CK) (CE 2.7.3.2) también se conoce como creatina fosfocinasa, que existe principalmente en el corazón, músculo, y cerebro. Puede catalizar reversiblemente la reacción trans-fósforo entre la creatina y el ATP. Es una quinasa importante directamente relacionada con el transporte de energía celular, Contracción muscular y regeneración de ATP.

CK cataliza la creatina fosfato y ADP para generar creatina y ATP, La hexoquinasa cataliza el ATP y la glucosa para generar glucosa-6-fosfato, y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa cataliza la glucosa-6- fosfato y NADP+ para generar NADPH, resultando en un aumento de 340 valor de absorción de luz nm, que se utiliza para expresar actividad enzimática CK.

Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados

Balanza, centrífuga de baja temperatura, baño maría a temperatura constante, espectrofotómetro, 1 Ml Cuvette de cuarzo y agua destilada.

Procedimiento

I. Extracción de la solución enzimática cruda:

1. 1. Muestra de tejido:

La proporción de masa de tejido (gramo): Volumen de solución de extracto (mililitros): 1:5~10 (se recomienda pesar sobre 0.1 g de tejido, agregar 1 mL de solución de extracto) Para la homogeneidad del baño de hielo. Centrifugar en 10000 ×g para 15 minutos a las 4 ℃, Tome el sobrenadante y colóquelo en hielo para probar.

2. muestra de suero:

Determinación directa.

3. muestra celular:

El número de celdas (104): el volumen de la solución de extracto(mililitros) es 500 ~ 1000:1 (1 Se recomienda agregar ml de solución de extracto a 5 millones de células), Se agrega la solución de extracto, y las células se rompen por onda ultrasónica en baño de hielo (Fuerza: 300W., ultrasónico: 3s, intervalo: 7s, Tiempo Total: 3 minutos). Centrifugar en, 10000×g para 10 minutos a las 4 ℃, el sobrenadante y colóquelo en hielo para probar.

II. Prueba procedimiento:

1. Precaliente el espectrofotómetro por más de 30 minutos, ajustar la longitud de onda a 340 Nuevo Méjico, y ajustar a cero con agua destilada.
2. Solución de trabajo: Mezclar reactivo I, Reactivo II, Reactivo III, Reactivo IV y reactivo V en la proporción de 70:4:7:10:90 (relación de volumen) antes de usar. Prepárese cuando se use la solución. Incubar para 20 Minutos en la temperatura ambiente antes de usar (Este paso no se puede omitir).
3. mesa de operaciones: Agregue los siguientes reactivos a 1 Ml cubeta

Nombre del reactivo (µL)	tubo en blanco (AB)	Tubo de ensayo (EN)
Solución enzimática cruda	–	200
Solución de trabajo	450	450
Agua destilada	550	350
Agregue los reactivos anteriores al 1 cubeta de cuarzo de ml respectivamente, Mezclarlos bien y medir el valor de absorbancia A1 en 340 nm para 10 s, colóquelos rápidamente en un baño de agua de 37 ℃ para 3 minutos (El lector de microplacas controlado por temperatura se puede configurar en 37 ℃), Saque el valor de absorbancia A2 en 190 sy calcule el Δat = a2t- A1t, ΔAb = A2B- A1B, ΔA = Δat-ΔAb. El tubo en blanco solo necesita hacerse de 1 a 2 veces.

III. Cálculo de CK:

• Calculado por concentración de proteína tisular:

Definición de actividad enzimática: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la producción de 1 nmolof nadph por minuto a 37 ℃ y ph7.0 cada miligramo de proteína.

Actividad de CK (Prot. U/mg) = ΔA ÷(ε×d)× VRT × 109 ÷ (VS × CPR) ÷ t = 268 × ΔA ÷ CPR

• Calculado por la calidad de las muestras de tejido:

Definición de actividad enzimática: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la producción de 1 NMOL de NADPH por minuto a 37 ℃ y Ph7.0 en cada gramo de muestra.

Actividad de CK (U/g peso fresco) = ΔA ÷(ε×d)× VRT × 109 ÷ (VS ÷ VST × W) ÷ t = 268 × ΔA ÷ W

• Calculado por volumen sérico:

Definición de actividad enzimática: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la producción de 1 NMOL de NADPH por minuto a 37 ℃ y Ph7.0 en cada mililitro de suero.

Actividad de CK (unidades/mL) = ΔA ÷(ε×d)× VRV × 109 ÷ vs ÷ t = 268 × ΔA

• Por recuento de células:

Definición de actividad enzimática: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la producción de 1 nmol de nadph por minuto a 37 ℃ y ph7.0 cada 10000 células.

Actividad de CK (U/104 celdas)=ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS ÷ VST × N)÷ t = 268 × ΔA ÷ N

 

mi: Coeficiente de extinción molar de NADPH, 6.22×103 L/mol/cm; d: Diámetro de luz de la cubeta, 1 cm;

VRT: Volumen total del sistema de reacción, 0.001 mililitros;

contra: El volumen de muestra en el sistema de reacción, 0.2 mililitros; VST: El volumen de la solución de extracto, 1 mililitros;

RCP: Concentración de proteína de muestra, mg/mL; W.: La masa de masa de muestra, gramo;

norte: El número de celdas, 104 unidades; t: tiempo de reacción, 3 minutos.

Nota:

1. El CK del suero no es estable. Las muestras se recolectan y miden lo antes posible. El CK del suero es estable para 24 horas después de ser almacenado a las 4 ℃ en la oscuridad.
2. El contenido de proteína de la muestra debe determinarse por separado. proteína BCA El kit de determinación de contenido se puede utilizar para determinar.
3. Si el valor de OD es mayor que 0.6, La muestra se puede diluir correctamente con la solución de extracto, y la fórmula de cálculo se puede cambiar según la relación de dilución.
4. Δab generalmente no excede 01.

Instancias experimentales：

1. Tomar 0.1g de cerebro del ratón, agregue 1 ml de solución de extracto, homogeneizar y moler. tomar el sobrenadante, luego diluir con extracto 4 tiempos y detectar de acuerdo con los pasos medidos. Calcule Δat = a2t- A1T = 0.638-0.149 = 0.489, ΔAb = A2B-A1B = 0， ΔA = ΔAT-ΔAB = 0.489-0 = 0.489, calcular la actividad enzimática según el peso de la muestra:

Actividad CK （U/G Peso） = 268 × ΔA ÷ W × 4 （Relación de dilución） = 268 × 0.489 ÷ 0.1 × 4 （Relación de dilución）

= 5242.08u/g de peso.

2. Tome 200 μl de suero de pato para detectar directamente, Calcule ΔAT = A2T-A1T = 0.445-0.423 = 0.022, ΔAb = A2B- A1b = 0, ΔA = ΔAT-ΔAB = 0.022-0 = 0.022, Calcule la actividad enzimática de acuerdo con el volumen de suero:

Actividad CK （U/ml） = 268 × ΔA = 268 × 0.022 = 5.896 U/ml.

Referencias：

• Defang li, En Lu, Jichunhan, et al.eriodictyol atenúa la lesión de isquemia-reperfusión de miocemia a través de la activación de JAK2. Fronteras en inmunología. Enero de 2018;(If3.845)
• Xu Y, Meng x, Hou x, et al. Un mutante del buthusmartensiikarsch antitumor-analgésico exhibe la inhibición de la hnav1. 4 y hnav1. 5 canales mientras conserva la actividad analgésica[j].Revista de Química Biológica, 2017, 292(44):18270-18280

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