No gato: BC3830

Tamaño: 50T/48S

Almacenamiento： Los reactivos se transportan a temperatura ambiente., almacenado según sea necesario después de la llegada, y estable dentro 0.5 años.

Composición de productos

Reactivo ⅰ: 20 mL×1. Almacenamiento a -20 ℃；

Reactivo ⅱ: 60 mL×1. Almacenamiento a -20 ℃.

Reactivo Ⅲ: 0.55 mL×1. Almacenamiento a -20 ℃, evitar la luz. 5estándar pNA mM: 1 mL×1. Almacenamiento a -20 ℃, evitar la luz.

Preparación del diluyente estándar: llevar 9 mL de Reactivo Ⅰ y agregar 1 mL de reactivo Ⅱ, mezclar bien, y espera para usar. (También se puede preparar según la proporción del reactivo Ⅰ.: Reactivo Ⅱ = 9:1).

Descripción del Producto:

La caspasa es una familia de proteasas implicadas en el proceso de apoptosis., incluyendo más de 10 miembros. Caspasa-3 es la proteasa terminal más importante en el proceso de apoptosis., y también es la caspasa más estudiada; activa la pro-caspasa-2,6,7,9, hidroliza específicamente una variedad de proteínas apoptóticas clave, como PARP, y media la condensación de la cromatina, formación de cuerpos apoptóticos, y fragmentación del ADN nuclear.

El ensayo colorimétrico de caspasa-3 se basa en la hidrólisis del sustrato peptídico DEVD-pNA. (Áspid- Glu-Val-Asp-p-nitroanilida) por caspasa-3, dando como resultado la liberación de la p-nitroanilina (pNA) mitad. pag- La nitroanilina tiene una alta absorbancia en 405 Nuevo Méjico. La actividad de Caspasa se puede calcular detectando pNA.. Este kit es adecuado para células y tejidos de mamíferos..

Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados:

Lector de espectrofotómetro/microplato, 100Cubeta μL/placa de 96 pocillos, centrífugo, baño de agua/incubadora, pipeta ajustable, mortero/homogeneizador, hielo, y agua destilada.

Procedimiento:

A. preparación de la muestra:

1. Células: recoger las células en el tubo de centrífuga, centrifugar y desechar el sobrenadante; agregue 100 μL de reactivo Ⅱ al número de células (acerca de 106 células), agitar y resuspender el precipitado, luego párese sobre hielo durante 15 min., centrifugar 15000g a 4℃ para 10 15 mín., tomar el sobrenadante y colocarlo en hielo durante (se puede aumentar a 150-200 μL Reactivo Ⅱ si el craqueo no es suficiente)
2. Tejido: según la proporción de masa tisular (gramo): Reactivo Ⅱ volumen (mililitros) de 1:5-10 (se recomienda pesar sobre 0.1 g de tejido y agregar 1 mL de reactivo Ⅱ), triturarlo en un baño de hielo o cortarlo bien, colóquelo en hielo para 15 mín., centrifugarlo a 4 ℃ durante 10-15 mín., Tome el sobrenadante y colóquelo en hielo para probar.

B. Determinación procedimiento:

1. Precaliente el espectrofotómetro/lector de microplacas durante 30 minutos, ajustar la longitud de onda a 405 Nuevo Méjico, y ajustar el agua destilada a cero.
2. Antes de usar, 5 La solución estándar de PNA mmol/L se diluye a 200, 100, 50, 25, 5, y 0 μmol/L solución estándar con diluyente de solución estándar.
3. Determinación de muestras (agregue los siguientes reactivos en secuencia en 96 buen plato / EPtubo)

Nombre del reactivo (μL)	Tubo de ensayo (EN)	tubo en blanco (AB)	tubo estándar (COMO)
reactivo yo	40	40
muestra	50
Reactivo II		50
Reactivo III	10	10
solución estándar			100
Mezclar bien, cubrir 96 bien los platos bien, y sellar con film sellador. Incubar a 37 ℃ durante 60-120 minutos. Cuando el cambio de color es evidente, la absorbancia en 405 se puede determinar. Si el cambio de color no es obvio, el tiempo de incubación se puede ampliar adecuadamente, incluso durante la noche. Los tubos vacíos sólo necesitan 1-2 veces. Calcular ΔAT =AT-AB.			Determine inmediatamente la absorbancia a 405 nm.

C. Actividad cálculo:

1. Establecimiento de la curva estándar.

La ecuación estándar se realiza según la concentración del tubo estándar. (X, µmol/L) y ΔAS (y, menos el tubo con 0 concentración). La determinación de ΔAT se sustituye en la ecuación estándar para obtener x (µmol/L).

2. Según el mayor porcentaje de actividad enzimática.

Mayor porcentaje de actividad caspasa-3 = ((grupo de tratamiento experimental AT)- AB) / ((grupo de control experimental en)- AB) × 100%

El método es sencillo y fiable y puede utilizarse para determinar la actividad enzimática de forma aproximada..

3. Calculado por actividad enzimática.

Una unidad es la cantidad de enzima que se escindirá. 1.0 nmol de sustrato colorimétrico de pNA por hora a 37 ℃ en concentraciones de sustrato saturadas. Podemos calcular la actividad de caspasa en la muestra..

Actividad de caspasa-3 (Prot. U/mg) = x × Vuial (VS × RCP ) ÷ T × 103 = 2x ÷ Cpr ÷ t

realidad virtual: volumen total del sistema de reacción, 0.1 ml = 10-4 l; contra: volumen de muestra agregada, 0.05 mililitros; t: tiempo de reacción, 1 h; RCP: concentración de proteína de muestra, mg/mL; 103: coeficiente de conversión de unidades, 1 µmol = 103 nmol.

Nota:

1. Dado que el reactivo I contiene un agente reductor (TDT), se recomienda diluir la muestra 2 veces con agua destilada y luego usar el método Bradford para determinar la concentración de proteína para reducir la interferencia de la DTT en la determinación de la concentración de proteína.. No se recomienda utilizar el método BCA para determinar la proteína.
2. La razón más común para el bajo valor de actividad de caspasa es que las células no han sufrido apoptosis., la cantidad de células es demasiado pequeña o el tiempo de observación es Cuando se induce la apoptosis, no es que cuanto mayor sea la dosis, cuanto más largo sea el tiempo, cuanto mayor sea la actividad de caspasa. Se recomienda establecer diferentes dosis y tiempos como 0, 2, 4, 8, 16, y 24 horas para detectar el mejor punto de observación.
3. Cuando el valor de la muestra medida es superior al límite superior de la curva estándar, la muestra se puede diluir con el Reactivo Ⅱ y luego volver a medir.
4. Cubra bien la placa de 96 pocillos y séllela con parafilm. Incubar en 37 ºC, El valor OD405 cuando el color se vuelve amarillo es aproximadamente 0.2, que se puede medir en este momento. El cambio de color insignificante puede prolongar la reacción o pasar la noche., pero cuando la actividad enzimática es fuerte, Un tiempo de incubación demasiado prolongado hará que la reacción pierda la linealidad.

Citas recientes de productos：

• Wang B. , Wang K. , Jin T , et al. NCK1-AS1 mejora la proliferación de células de glioma, radiorresistencia, y quimiorresistencia a través de la vía del ceRNA miR-22-3p/IGF1R[j]. Biomedicina & Farmacoterapia, 2020, 129:110395.
• Wang Z , Xu JH , Mou JJ , et al. Nuevos hallazgos ultraestructurales en las mitocondrias cardíacas de los campañoles de Brandt apiñados en un ambiente frío y templado[j]. Bioquímica y fisiología comparadas – Parte A Molecular & Fisiología Integrativa, 2020, 249:110766.

Referencias:

• Cohen GM. caspasas: los verdugos de la apoptosis. Bioquímica J., 1997, 326:1-16.
• JanickeR U, Sprengart M L, Wati M R, et Papel emergente de la caspasa-3 en la apoptosis[j]. Muerte celular y diferenciación, 1999, 6:99-104.

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