Solarbio β-galactosidasa (β-GAL) Kit de ensayo

β-galactosidasa (β-GAL) Kit de ensayo

Nota: Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba..

Equipo de operación: Lector de microplacas/espectrofotómetro

Numero de catalogo: antes de Cristo2585

Tamaño:100T/48S

Componentes:

Extraer solución: Líquido 100 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Solución I: Polvo × 1. Almacenamiento a -20 ℃. Agregar 2.55 mL de agua destilada por botella antes de usar y disolverla completamente. La tienda de reactivos izquierda a -20 ℃.

Solución Ⅱ: Líquido 4 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Solución Ⅲ: Líquido 15 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Estándar: Líquido 1 ml × 1. Almacenamiento a 4 ℃. 5 solución de p-nitrofenol μmol/mL.

Descripción del Producto

β-galactosidasa (β-GAL, CE 3.2.1.23) Es una enzima que se encuentra ampliamente en los animales., plantas, microorganismos y células cultivadas, que puede catalizar la hidrólisis de enlaces β-galactosilo y también tiene la función de transglicosilación. β-GAL puede liberar energía almacenada para el rápido crecimiento de las plantas, También cataliza la degradación de polisacáridos., glicoproteínas, y galactosa residuos de galactosa terminales en el metabolismo normal de polisacáridos, Metabolismo de los componentes de la pared celular y durante el envejecimiento de la pared celular para liberar galactosa libre..

β-GAL puede catalizar el p-nitro fenil-β-pirano galactósido a p-nitro fenol. El producto tiene características de absorción a 400 Nuevo Méjico. en este equipo, La actividad β-GAL se cuantifica midiendo el aumento en el desarrollo del color en 400 Nuevo Méjico.

Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados.

Lector de microplacas o espectrofotómetro, centrífugo, baño de agua, pipeta de transferencia, cubeta de microvidrio/placa de fondo plano de 96 pocillos, hielo, mortero/homogeneizador y agua destilada.

Procedimiento

I. Preparación de muestras estándar.:

1. Bacterias o células

Recoger bacterias o células en el tubo de centrífuga., después de la centrifugación desechar el sobrenadante. Sugerir agregar 1 mL de solución de extracto para 5 millones de bacterias o células. Utilice ultrasonidos para dividir bacterias y células. (colocado sobre hielo, poder ultrasónico 20%, tiempo de trabajo 3 segundos, intervalo 10 segundos, repetir para 30 veces). Centrifugar a 15000×g para 20 minutos a 4 ℃ para eliminar materiales insolubles y tomar el sobrenadante en hielo antes de realizar la prueba.

2. Tejido

Agregar 1 mL de solución de extracto para 0.1 g de tejido, y completamente homogeneizado en baño de hielo. Centrifugar a 15000×g para 20 minutos a 4 ℃ para eliminar materiales insolubles, y tomar el sobrenadante en hielo antes de realizar la prueba..

II. Determinación

1. Precaliente el lector de microplacas o el espectrofotómetro durante más de 30 minutos, ajustar la longitud de onda a 400 Nuevo Méjico, poner a cero con agua destilada.
2. Estándar Diluir la solución a 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 nmol/mL con agua destilada.

3. Agregue reactivos con la siguiente lista:

Reactivo	Tubo de ensayo (t)	Tubo de contraste (C)	Tubo estándar (S)
Solución I (µL)	25	–	–
Agua destilada (µL)	–	25	–
Solución Ⅱ (µL)	35	35	–
Muestra (µL)	10	10	–
Mezclar bien e incubar la reacción durante 30 minutos en baño de agua a 37 ℃.
Estándar (µL)	–	–	70
Solución Ⅲ (µL)	130	130	130

Mezclar bien. Detectar la absorbancia de cada tubo en 400 nm y anotado como AT, C.A., AS y AB. Calcular

ΔAT= AT – C.A., ΔAS = AS – AB. Cada tubo de ensayo debe contar con un tubo de contraste..

III. Calcular:

1. Curva estándar

Curva estándar establecida: Según la concentración del tubo estándar. (nmol/mL) y absorbancia ΔAS= AS – AB (X), establecer la curva estándar. Agregue ΔA a la curva estándar, y calcular la cantidad de producto generado por la muestra (nmol/mL).

2. Cálculo

• Concentración de proteína tisular

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzimas que cataliza la generación de 1 nmol de p-nitrofenol en el sistema de reacción por hora, cada mg de proteína.

Actividad β-GAL(Prot. U/mg)=(y×Vrv)÷(Vs×Cpr)÷T=14×y÷Cpr

• Peso del tejido

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzimas que cataliza la generación de 1 nmol de p-nitrofenol en el sistema de reacción por hora, cada g de muestra.

Actividad β-GAL(u/g )= (y×Vrv)÷(W×Vs÷Ve)÷T=14×y÷W

• Bacterias o células cultivadas.

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzimas que cataliza la generación de 1 nmol de p-nitrofenol en el sistema de reacción por hora, cada 104 bacterias o células.

Actividad β-GAL(celda U/104)=(y×Vrv)÷(500×Vs÷Ve)÷T=0,028×y

RCP: Concentración de proteína de muestra sobrenadante. (mg/mL); Soga: Volumen total de reacción, 0.07 mililitros;

contra: volumen sobrenadante, 0.01 mililitros; ve: Volumen de solución de extracción,1 mililitros;

t: Tiempo de reacción (mín.), 30 minutos = 0.5 hora; W.: Peso de la muestra, gramo;

500: 5 Millones de células o bacterias..

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