Was ist PCR Master Mix? qpcr mix? Wie machst du es??

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist ein wesentliches Werkzeug in der molekularen Biologie und Diagnostik. Im Herzen jeder PCR -Reaktion steht der Master -Mix – Ein vorgefertigter Cocktail mit allen wichtigen Zutaten für die DNA -Verstärkung. Aber was genau in diese entscheidende PCR -Komponente geht? Und welche Überlegungen sollten die perfekte Master -Mischung für Ihre Experimente formulieren sollten? Dieser umfassende Leitfaden bricht alles in einfachen Worten nieder.

Was ist ein PCR -Master -Mix??

A PCR Master Mix ist ein vorgemischtes, Ready-to-Use-Lösung mit allen wesentlichen Komponenten für die Polymerasekettenreaktion mit Ausnahme der DNA-Vorlage und Primer. Es beinhaltet normalerweise:

• DNA -Polymerase -Enzym
• Desoxynukleotide (dNTPs)
• Reaktionspuffer
• Magnesiumchlorid
• Stabilisatoren und Enhancer

Durch die Vorbereitung eines Master -Mixes, Sie können die gleiche optimierte Formulierung in mehreren Reaktionsrohre oder Brunnen einer Platte aliquotieren. Dies spart Zeit, reduziert Fehler, und verbessert die Konsistenz im Vergleich zum Hinzufügen jeder Komponente einzeln zu jeder Reaktion.

Master-Mixe sind ein PCR-Game-Changer, Aktivieren eines vereinfachten Hochdurchsatz-Experiment-Setups. Egal, ob Sie Routine -PCRs durchführen oder Tausende von Proben analysieren, Ein Master -Mix rationalisiert den Workflow.

Was sind die Arten von PCR -Meistermischungen?

Es gibt viele Master -Mix -Produkte, die für verschiedene Arten von PCR -Anwendungen optimiert sind:

• Standard -PCR –Für die routinemäßige DNA -Amplifikation. Enthält nicht-öfter Lesenpolymerasen.
• High-Fidelity-PCR– Verwendet Korrekturlesen Polymerasen zum Klonen, Sequenzierung, oder Anwendungen, die eine hohe Genauigkeit erfordern.
• Multiplex PCR – Enthält ausgewogene Primer, um mehrere Ziele in einer Reaktion zusammenzuführen.
• Echtzeit QPCR – Beinhaltet fluoreszierende Reporter wie Sonden oder DNA -Farbstoffe zur Quantifizierung.
• RT-PCR – Enthält eine umgekehrte Transkriptase -Enzym zur Amplifikation von RNA -Vorlagen.
• Heiße Start -PCR – Verwendet inhibitor-blockierter wärmeaktivierter Polymerase, um die Spezifität zu verbessern, indem falsche Amplifikationsprodukte reduziert werden.
• Schnelles Radfahren PCR – Ermöglicht schnelle Thermocycling -Protokolle für einen erhöhten Durchsatz.

Viele Master-Mischungen werden auch für bestimmte PCR-Instrumente oder Erkennungschemien wie Taqman-Sonden voroptimiert. Passen Sie also die spezielle Mischung an Ihr spezielles PCR -Protokoll an, Ziele, und Plattform für die besten Ergebnisse.

QPCR-Master-Mix für Echtzeit-Experimente

Für quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) Experimente, Spezialisierte qPCR -Mastermischungen enthalten fluoreszenzmarkierte Sonden oder DNA -Bindungsfarbstoffe, um die Nachweis und Quantifizierung von PCR -Produkten zu ermöglichen „Echtzeit“ Während des Thermocyclings.

Einige gängige Echtzeit-QPCR-Master-Mix-Typen enthalten:

• SYBR Grün – Interkalierender Farbstoff, der fluoresziert, wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden ist.
• Taqman -Sonde – Während der Verstärkung gespalten.
• Molekulares Leuchtfeuer – Fluoreszierende Haarnadelsonden mit einem Quencher, um den Hintergrund zu reduzieren.
• Hybridisierungssonde – Bühnenbasierte benachbarte Sonden für die Signalerzeugung.

Die Verwendung eines für Ihre speziellen QPCR -Erkennungschemie formulierten und optimierten Master -Mix vereinfacht die Reaktionsaufnahme und bietet zuverlässig, Sensible Ergebnisse.

Wie man einen PCR -Master -Mix erstellt?

Während hochwertige kommerzielle Master-Mixprodukte weit verbreitet sind, Sie können auch Ihre benutzerdefinierte PCR -Master -Mischung durchführen. Hier sind die wichtigsten Schritte beteiligt:

1. Wählen Sie ein DNA -Polymerase -Enzym

Dies ist die wichtigste Komponente, die die DNA -Amplifikation katalysiert. Zu den beliebten Optionen gehören Taq, Pfu, Q5, PHUSION, CODE, Tth. Betrachten Sie die Prozessivität, Genauigkeit, Verlängerungsrate, und Kompatibilität mit PCR -Puffern bei der Auswahl eines Enzyms.

2. Bereiten Sie einen optimierten PCR -Reaktionspuffer vor

Der Puffer bietet einen idealen pH -Wert, Salzkonzentrationen, und Cofaktorkompatibilität für die Polymeraseaktivität. Gemeinsame Komponenten sind:

• Tris-hcl pH 8.5 – Behält den neutralen pH bei Verlängerungstemperaturen bei
• Kcl oder (Th4)2SO4 – Monovalente Kationen für Leitfähigkeit
• MgCl2 – Essentielles zweiwertiges Kationen -Cofaktor für Polymerase
• PCR -Verbesserungen – Betain, DMSO, Stabilisatoren wie BSA

3. Fügen Sie ausgewogene Desoxynukleotide hinzu (dNTPs)

Verwenden Sie eine äquimolare Mischung aus DATP, dCTP, dGTP, dTTP. Die Standardkonzentration ist 100-200 jeweils μm Dntp.

4. Wesentliche Cofaktoren einbeziehen

Magnesiumchlorid (MgCl2) ist ein entscheidender Cofaktor für die Polymeraseaktivität und Spezifität. Einschließen at 1-5 MM Endkonzentration.

5. Stabilisatoren hinzufügen

Nichtionische Waschmittel, DTT, Trehalose, usw. helfen bei der Aufrechterhaltung der Polymeraseaktivität während der Lagerung.

6. Passen Sie die Komponentenkonzentrationen an

Aus Bequemlichkeit, Machen Sie einen konzentrierten 2x- oder 4x -Master -Mix, indem Sie die Mengen von Komponenten verdoppeln oder vervierfachen.

7. Mischen Sie Komponenten gründlich vor Aliquotten

Vortex oder Pipette wiederholt, um einen homogenen Master -Mix zu gewährleisten.

8. Machen Sie Aliquots einzelner Gebrauch für die Aufbewahrung

Vermeiden Sie Einfrieren-Tau-Zyklen. Für beste Ergebnisse, Vor dem Gebrauch gefrorene und auftauchen Aliquots auf Eis lagern.

Wenn Sie Ihren Master -Mix zum ersten Mal entwickeln, Befolgen Sie die vom Polymerasehersteller vorgeschlagenen Pufferrezepte und Komponentenkonzentrationen als Ausgangspunkt.

Optimieren Sie die Konzentrationen durch iterative Tests, um die Effizienz zu maximieren, Spezifität, Empfindlichkeit, und Konsistenz für Ihr spezielles PCR -Protokoll, Instrument, und Anwendung.

So verwenden Sie einen PCR -Master -Mix

Die Verwendung einer PCR -Master -Mischung in Ihren Reaktionen könnte nicht einfacher sein. Hier finden Sie eine schnelle Schritt-für-Schritt-Übersicht:

1. Auftauen – Lassen Sie den gekühlten Master auf Eis vollständig auftauen.
2. Wirbel – Mischen Sie gut, indem Sie Vor- oder Pipettieren auf und ab pipettieren, um die Homogenität vor dem Aliquoting zu gewährleisten.
3. Aliquot – Geben Sie das geeignete Volumen des Master -Mix pro Reaktion in PCR -Röhrchen oder Plattenbrunnen an, basierend auf der Reaktionsgröße.
4. Fügen Sie Primer hinzu – Pipette nach vorne und umkehren Primer in jedes Reaktionsrohr/Vertiefung um.
5. Vorlage hinzufügen – Fügen Sie jeder Reaktion die DNA -Probe oder andere Vorlage hinzu.
6. Nachfüllen – Bei Bedarf, Fügen Sie zusätzliches Wasser hinzu, um das endgültige gewünschte Reaktionsvolumen zu erreichen.
7. Mischen – Vorsichtig Wirbel oder Pipettenmisch, um alle Komponenten in jeder Reaktion zu kombinieren.
8. Zentrifuge – Kurz drehen Sie Röhrchen/Platten, um den Inhalt unten zu sammeln.
9. PCR – Legen Sie die Reaktionen in einen thermischen Zykler und starten Sie Ihren PCR -Lauf!

Wenn Sie einen Master -Mix verwenden, Fügen Sie immer zuletzt die DNA -Vorlage hinzu, Nach den Primern, Um eine Kreuzkontamination zwischen den Reaktionen zu vermeiden.

Wie PCR Master Mix DNA -Amplifikation versorgt?

Ein PCR-Master-Mix enthält die wesentlichen Inhaltsstoffe für die DNA-Verstärkung in einem Gebrauchsformat. Die Verwendung eines Master -Mix vereinfacht das Reaktionsaufbau, reduziert Fehler, und verbessert die Konsistenz.

Für Standard -PCR sind verschiedene Arten von optimierten Mastermischungen erhältlich, qPCR, High-Fidelity-PCR, RT-PCR, und mehr. Sie können auch Ihren eigenen maßgefertigten Mix erstellen, Gewerbliche Produkte bieten jedoch umfangreiche Qualitätstests und Komfort.

Das Verständnis der PCR -Master -Misch. Mit der Kraft des Master -Mixes in Ihrem molekularen Biologie -Toolkit, DNA -Experimente wird einfach.