Solarbio Succinat-Dehydrogenase (SDH) Aktivitätstest-Kit

Succinat-Dehydrogenase (SDH) Aktivitätstest-Kit

Notiz: Nehmen Sie vor dem Test zwei oder drei verschiedene Proben zur Vorhersage.

Erkennungsausrüstung: Spektrophotometer

Katze nein: BC0950

Größe: 50T/48S

Komponenten

Reagenz I: 60 ml×1, Speichern Sie bei -20 ℃. Reagenz II: 0.6 ml×1, Speichern Sie bei -20 ℃. Reagenz III: 5 ml×1, Speichern Sie bei 4 ℃.

Reagenz IV: Pulver×1, Speichern Sie bei 4 ℃. Wenn die Lösung verwendet wird, Fügen Sie es in das Reagenz III hinzu, um sie für die Verwendung aufzulösen.

Reagenz V: Pulver×1, Speichern Sie bei 4 ℃. Hinzufügen 4 ml destilliertes Wasser, wenn die Lösung verwendet wird, Die ungenutzten Reagenzien werden bei 4 ℃ gespeichert.

Reagenz VI: Pulver×1, Speichern Sie bei -20 ℃. Hinzufügen 3.333 ml destilliertes Wasser, wenn die Lösung verwendet wird, Die ungenutzten Reagenzien werden bei 4 ℃ gespeichert.

Beschreibung

Succinat-Dehydrogenase (SDH, EC 1.3.5.1) ist bei Tieren weit verbreitet, Pflanzen, Mikroorganismen und kultivierte Zellen. SDH ist ein Markerenzym von Mitochondrien, Das ist ein Membranbindungsenzym in der inneren Membran von Mitochondrien. Es ist auch einer der wichtigsten Punkte des Elektronentransfers und der oxidativen Phosphorylierung. Zusätzlich, Es liefert Elektronen für die Atemkette verschiedener prokaryotischer Zellen.

SDH kann die Dehydrierung von Succinsäure zu Fumarsäure katalysieren. Die Dehydrierung kann 2,6-Dichlorphenol-Indophenol reduzieren (DCPIP) unter der Übertragung von Phenazin -Dimethylsulfat (PMS). 2,6- DCPIP hat einen charakteristischen Absorptionspeak bei 600 nm. Die Reduktionsrate von 2,6 dcpip wird durch die Änderung der Absorption bei bestimmt 600 nm, Dies repräsentiert die Aktivität des SDH -Enzyms.

Erforderlich, aber nicht bereitgestellt

Spektrophotometer, Wasserbad, Tabletop -Zentrifuge, verstellbare Pipette, Mörtel/Homogenisator, 1 ML Glass Cuvette, Eis und destilliertes Wasser.

Protokoll

ICH. Extraktion von SDH:

Genau wiegen 0.1 G Gewebe oder Sammeln 5 Millionen Zellen, hinzufügen 1 ml Reagenz I und 10 μl von Reagenz II II, Homogenisieren Sie Homogenisator/Mörtel im Eisbad, voll mahlen, Zentrifuge bei 11000 ×g für 10 Minuten bei 4 ℃, Nehmen Sie den Überstand und legen Sie ihn zum Testen auf Eis.

II. Verfahren

1. Spektrophotometer vorheizen 30 Protokoll, Wellenlänge anpassen 600 NM und Null mit destilliertem Wasser einstellen.
2. Verfahrenstest

Fügen Sie jedes Reagenz hinzu zu 1 ML Glass Cuvette nacheinander, und mit dem Zeitpunkt gleichzeitig mit dem Hinzufügen von Reagenz VI mit dem Zeitpunkt beginnen, Notieren Sie die anfängliche Absorption A1 bei der Wellenlänge von 600 NM für 20 Sekunden. Legen Sie dann die Küvette mit der Reaktionslösung in ein Wasserbad von 37 ℃ zusammen (Säugetier) oder 25 ℃ (andere Arten), und genaue Reaktion für 1 Minute. Nehmen Sie schnell die Küvette heraus und trocknen Sie sie, und zeichnen Sie die Absorption A2 auf 80 Sekunden bei 600 nm. ΔA = A1-A2, ΔAT erhalten, ΔAB.

III. Berechnung von SDH Aktivität

Berechnungsformel zur Bestimmung mit 1 ML Glass Cuvette.

• Proteinkonzentration

Einheitendefinition: Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die Menge des Enzyms, die der verbrauchte von katalysiert 1 Nmol von 2,6-Dichlorphenol-Indophenol pro Minute im Reaktionssystem jedes Milligrammgewebeprotein.

SDH(U/mg-Schutz)＝[(ΔAT-ΔAB)÷(ε×d)× VRV × 109]÷(CPR × vs) ÷ t ＝ 1555,556 ×(ΔAT-ΔAB)÷ CPR

• Probengewicht

Einheitendefinition: Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die Menge des Enzyms, die der verbrauchte von katalysiert 1 Nmol von 2,6-Dichlorphenol-Indophenol pro Minute im Reaktionssystem jedes Grammgewebe.

SDH(U/g)＝[(ΔAT-ΔAB)÷(ε×d)× VRV × 109]÷(Vs ÷ vst × w) ÷ t ＝ 1571.111 ×(ΔAT-ΔAB)÷ w

• Keim oder Zellen

Einheitendefinition: Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die Menge des Enzyms, die der verbrauchte von katalysiert 1 Nmol von 2,6-Dichlorphenol-Indophenol pro Minute im Reaktionssystem 10 Tausend Keim- oder Zellen.

SDH(U/104 -Zelle)＝[(ΔAT-ΔAB)÷(ε×d)× VRV × 109]÷(VS ÷ VST × 500) ÷ t

＝ 3.142 ×(ΔAT-ΔAB)

Vrt: Gesamtreaktionsvolumen, 0.98×10-3 L;

e: Der Molarenextinktionskoeffizient von 2,6-dcpip, 2.1× 104 l/mol/cm; D: Der Lichtdurchmesser der Küvette, 1 cm;

Vs: Probenvolumen, 0.03 ml;

VST: Fügen Sie das Volumen von Reagenz I und Reagenz II hinzu, 1.01 ml; T: Reaktionszeit(Mindest), 1 Minute;

Cpr: Proteinkonzentration der Probe, mg/ml; W: Probengewicht, G;

500: Zellen oder Keim, 5 Million.

Notiz

1. Alle Reagenzien und Proben müssen während der Bestimmung auf Eis gelegt werden, um Denaturierung und Deaktivierung zu vermeiden.
2. Wenn ΔA größer ist als 0.5, Die Enzymlösung sollte mit Enzymextrakt verdünnt werden, um ΔA mit weniger als zu erhalten 0.5, Dies kann die Erkennungsempfindlichkeit verbessern.
3. Weil die Extraktlösung eine bestimmte Proteinkonzentration enthält (um 1 mg/ml), Es ist notwendig, den Proteingehalt der Extraktlösung selbst bei der Bestimmung der Proteinkonzentration der Probe zu subtrahieren.

Experimentelles Beispiel:

1. Nieren Sie 0,1 g Niere, hinzufügen 1 ml Reagenz ⅰ und 10 μl Reagenz ⅱ, Mahlen Sie das Homogenat mit Eisbad, Zentrifuge bei 4 ℃ und 11000 g für 10 Mindest, und legen Sie den Überstand auf Eis. Gemäß dem Bestimmungsverfahren, Die Enzymaktivität wird wie folgt berechnet: ΔAT = a1t- A2T = 0,82-0,681 = 0,139, ΔAB= A1B- A2B = 905-0,904 = 0,001

SDH -Aktivität (U/g-Masse) = 961.905 ×(ΔAT- ΔAB) ÷ w = 2168.13 U/g Masse.

Verweise

• Fakten p, Bertoni-Foldari c, Kisten u, et al. Beeinträchtigtes Bemerkung der Succinic -Dehydrogenase -Aktivität von Rattenpurkinje -Zell -Mitochondrien während des Alterns[J]. Mechanismen des Alterns und der Entwicklung, 1998, 101(1-2): 175- 182.

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