Bakterielle Gesamt-RNA (Plus) Extraktionskit

1. Bestandteile des Reagenzienkits

2. Lagerung

Dieses Reagenzienkit sollte bei Raumtemperatur gelagert werden (15-25℃) in einer trockenen Umgebung und kann z. B. konserviert werden 12 Monate. Lysozym enthält ein Konservierungsmittel, Ermöglicht den Transport bei Raumtemperatur; Jedoch, zur Langzeitlagerung, es sollte bei -20℃ gelagert werden

3. Anweisungen zur Verwendung des Reagenzienkits

3.1 Dieses Kit ist für molekularbiologische Forschungszwecke bestimmt und sollte nicht zur Diagnose oder Behandlung von Krankheiten verwendet werden.

3.2 Einige Bestandteile des Kits enthalten Reizstoffe; Es ist ratsam, die erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen zu treffen (wie das Tragen von Schutzkleidung und Schutzbrillen).

3.3 Die Verwendung dieses Kits erfordert zusätzliche Ausrüstung wie eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge, Wasserbad (Metallbad), Vortexmixer, Wasserfreies Ethanol, flüssiger Stickstoff, Chloroform, steriles entionisiertes Wasser, und EP-Röhren.

4. Einführung in das Reagenzienkit

Dieses RNA-Reinigungskit bietet eine schnelle und effiziente Reinigungslösung für bakterielle RNA, Geeignet für die meisten Bakteriengewebe. Das Kit nutzt die DNA-Entfernungstechnologie, um genomische DNA effektiv zu entfernen, und die resultierenden RNA-Proben erfordern normalerweise keinen Aufschluss auf der Säule, Verringerung des Risikos des RNA-Abbaus.

Das RNA Fast Purification Kit ermöglicht die Extraktion der gesamten bakteriellen RNA (einschließlich nuklearer RNA und zytoplasmatischer RNA) innerhalb 1 Stunde. Die extrahierte RNA kann direkt für RT verwendet werden-PCR, Northern Blot, usw. Der gesamte Reinigungsprozess beinhaltet keine giftigen Reagenzien wie Phenol-Chloroform, Dadurch eignet sich das RNA-Reinigungskit gut für verschiedene Probentypen.

5. Experimentelle Prinzipien und Verfahren

6. Extraktionsprozess

Vorsichtsmaßnahmen vor Beginn des Experiments:

A. Vor Gebrauch, Fügen Sie die angegebene Menge an absolutem Ethanol hinzu Waschpuffer 1 wie auf dem Etikett der Reagenzflasche angegeben, und mit einem Häkchen markieren, um die Zugabe von absolutem Ethanol anzuzeigen.

B. Elutionspuffer ist ein 0.1x TE-Lösung enthält eine minimale Menge EDTA. Wenn EDTA nachfolgende Experimente beeinflussen könnte, Es wird empfohlen, den Elutionspuffer durch steriles entionisiertes Wasser zu ersetzen.

1. Probenverarbeitung:

A. Grampositive Bakterien: Zentrifugieren Sie die Bakteriensuspension bei 4℃, 12,000 U/min für 2 Protokoll, Bakterienzellen sammeln (1.53 ml), Den Überstand verwerfen, hinzufügen 100μl Lysozym (10mg/ml), Mischen Sie die Bakterienzellen gründlich, und bei Raumtemperatur inkubieren für 15-30 Protokoll.

B. Gramnegative Bakterien: Zentrifugieren Sie die Bakteriensuspension bei 4℃, 12,000 U/min für 2 Protokoll, Bakterienzellen sammeln (1.53 ml), Den Überstand verwerfen, hinzufügen 10μl Lysozym (10mg/ml), Mischen Sie die Bakterienzellen gründlich, und bei Raumtemperatur inkubieren für 3-5 Protokoll.

2.Hinzufügen 400μl RNA-Extraktionspuffer I, Zum gründlichen Mischen vortexen.

3. Übertragen Sie das Lysat auf eine DNA-Clearance-Reinigungssäule, Zentrifuge bei 13,000 U/min für 2 Protokoll, Sammeln Sie das Filtrat (Im Filtrat ist RNA vorhanden).

4. Schätzen Sie das Volumen des Filtrats genau ab, hinzufügen 0.5 mal die Volumen absoluten Ethanols, gründlich mischen; wenn es zu Niederschlägen kommt, es hat keinen Einfluss auf nachfolgende Experimente.

5. Geben Sie die erhaltene Flüssigkeit in die RNA-Extraktions-Reinigungssäule (jedes Mal ungefähr 650 ~ 700 μl), Zentrifuge um mehr als 8,000 U/min für 1 Minute, Entsorgen Sie die gesammelte Abfallflüssigkeit, und setzen Sie das Sammelröhrchen für den nächsten Schritt wieder in die RNA-Extraktions-Reinigungssäule ein.

6. Schritt wiederholen 5, Geben Sie die restliche Flüssigkeit in die RNA-Extraktions-Reinigungssäule, Zentrifuge um mehr als 8,000 U/min für 1 Minute, Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit und das Sammelröhrchen.

7. Legen Sie die RNA-Extraktions-Reinigungssäule in ein neues Sammelröhrchen, hinzufügen 600μl -Inhibitorentfernungspuffer, Zentrifuge um mehr als 8,000 U/min für 1 Minute, Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit, und setzen Sie die RNA-Extraktions-Reinigungssäule für den nächsten Schritt wieder in das Röhrchen ein.

8. Hinzufügen 700μl Waschpuffer 1 zur RNA-Extraktions-Reinigungssäule, Zentrifuge bei 14,000 U/min (20,000×g) für 2 Protokoll, Verlängern Sie die Zentrifugationszeit entsprechend, um sicherzustellen, dass die Membran gründlich getrocknet ist.

(Notiz: Bestätigen Sie, dass das absolute Ethanol hinzugefügt wurde, um den Puffer zu waschen 1. Die Anwesenheit von Ethanol hat schwerwiegende Auswirkungen auf nachfolgende Experimente, Daher ist die Membrantrocknung von entscheidender Bedeutung. Nach Zentrifugation, Stellen Sie vor der Elution sicher, dass kein Ethanol vorhanden ist. Entsorgen Sie die Abfallflüssigkeit und das Sammelröhrchen.

Nach dem Waschen mit Waschpuffer 1, Die Membran der RNA-Extraktions-Reinigungssäule sollte nur eine leichte Farbe aufweisen. Nach Zentrifugation, Entfernen Sie vorsichtig die RNA-Extraktions-Reinigungssäule, ohne das Sammelröhrchen zu berühren, um sicherzustellen, dass es zu keinen Störungen durch Ethanol kommt.)

9. Legen Sie die RNA-Extraktions-Reinigungssäule in ein neues Zentrifugenröhrchen, tropfen 100 μl Elutionspuffer auf die Membran auftragen, bei Raumtemperatur inkubieren für 5 Protokoll (15°C~25°C), Zentrifuge um mehr als 8,000 U/min für 1 Minute.

(Notiz: Elusionsrna mit 50 μl Elutionspuffer kann die RNA-Konzentration erhöhen, aber die Gesamt-RNA-Ausbeute verringern.)

10. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt.

(Notiz: Zum Auffangen der beim zweiten Mal eluierten RNA kann ein neues Zentrifugenröhrchen verwendet werden, Alternativ kann das Original-Sammelröhrchen zum weiteren Sammeln von RNA verwendet werden.)