隨著分子生物學技術的發展, 各種檢測基因結構和突變的方法不斷湧現. 特別是在問世之後 聚合酶鍊式反應 科技, 與PCR結合的各種基因檢測技術進一步推動了基因研究的進步. 諸如不對稱PCR產品的直接測序之類的技術, 核糖核酸酶裂解 (最好), 和限製片段長度多態性分析 (RFLP) 已成為基因分析的強大工具. 然而, 這些方法相對繁瑣操作, 有重大的局限性, 或需要高實驗條件, 使它們不適合一般臨床實驗室.
引入 1989, PCR-SSCP (單鏈構象多態性) 經過了持續的改進和精緻, 使它變得更簡單, 快點, 以及更靈敏的方法檢測基因突變. 它不僅用於檢測點突變和短序列缺失和插入，而且還用於DNA定量, 監測PCR診斷實驗中的交叉污染, 並調查感染來源. 由於SSCP的出色優勢, 近年來已廣泛應用.
SSCP的原理和特徵
- 發現和基本概念:
- 單鏈DNA (ssDNA) 片段表現出複雜的空間折疊構象，由分子內相互作用維持, 主要是基礎配對.
- 單個基礎變化可以顯著或稍微改變空間構象, 導致聚丙烯酰胺凝膠中不同的遷移模式.
- 分離機制:
- 非換性聚丙烯酰胺凝膠電泳 (頁) 由於凝膠中的阻塞水平變化，可以急劇分離具有不同構象的ssDNA分子.
- SSCP分析:
- 命名單鏈構象多態性 (SSCP) 日本研究員Orita及其同事.
- 應用於檢測PCR擴增產物中的基因突變, 增強簡單性和靈敏度.
- 基本過程:
- PCR擴增: 擴增目標DNA.
- 變性和更新: 變性特定的PCR產物并快速重腎臟，以形成具有特定空間結構的單鏈DNA分子.
- 非貶低頁面: 在適當量的單鏈DNA上執行非換性聚丙烯酰胺凝膠電泳.
- 偵測: 使用射線照相自顯影分析結果, 銀色染色, 或溴化乙錠染色.
- 解釋:
- 與正常對照相比，ssDNA的遷移率的變化表明構象的變化, 暗示在該DNA片段中存在鹼基突變.
- 優點:
- 簡單的, 快速地, 和敏感方法.
- 不需要專用設備.
- 適用於臨床實驗室.
- 限制:
- 僅檢測突變; 需要進一步的測序來查明突變的確切位置和類型.
- 需要嚴格的電泳條件.
- 如果點突變沒有顯著改變ssDNA構象或其他條件干擾，則可能的假陰性.
- 檢測效率:
- 儘管有局限性, 與其他方法相比，SSCP具有高檢測率.
- 能夠識別靶DNA片段中未知的鹼基突變.
- 塔科（Takao）證明了SSCP可以檢測到 90% DNA片段中的單基突變的短 300 BP.
- 進一步的申請:
- SSCP可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離具有不同遷移速率的突變體ssDNA.
- 允許在序列水平上進一步純化和鑑定突變的DNA片段.
SSCP的發展和改進
- 最初的發展:
- 最初, SSCP涉及將同位素納入PCR擴增產品, 並通過放射自顯影顯示結果. 這給廣泛採用帶來了挑戰.
- 簡化:
- DNA銀染料與PCR-SSCP的組合, 特別是直接溴化乙錠染色的應用, 大大簡化了方法.
- 最近的值得注意的改進:
- RNA-SSCP分析:
- 基本原則: RNA具有更複雜的次級和三級構象, 使其對單基礎突變高度敏感, 因此增加了檢測率.
- 突變檢測率可以超過 90%.
- RNA不太容易形成雙鏈, 允許大量用於電泳, 這對溴化乙錠染色有益.
- 然而, 該方法添加了一個逆轉錄步驟，並且需要更長的含有RNA聚合酶啟動子序列的引物, 增加複雜性.
- RNA-SSCP分析:
- 將SSCP與其他突變檢測方法相結合:
- 異源分析 (它):
- 與SSCP結合時，可以顯著提高檢測率.
- 涉及雜交探針與靶標ssDNA或RNA. 含有不匹配的基對的混合鏈可以通過非污染PAG凝膠中的電泳與完全互補的雜化鏈分開.
- 在同一目標序列上同時進行SSCP和HET分析可以實現 100% 點突變的檢測率, 同時保持實驗簡單性.
- 異源分析 (它):
PCR-SSCP的過程
基於DNA片段長度的凝膠製備
對於DNA片段短於1KB, 選擇如下的聚丙烯酰胺凝膠的濃度:
- DNA片段長度 (BP): % 丙烯酰胺濃度
- 1KB – 700B: 3.5%
- 700B – 500B: 5%
- 500B-200B: 8%
- 200乙: 12%
SSCP前製劑
- PCR擴增: 放大最小塗抹的特定產品 (通過瓊脂糖凝膠電泳確認).
1. 聚丙烯酰胺凝膠的製備 (PAG)
- 根據上表的所需濃度準備凝膠溶液.
- 將梳子插入凝膠模具中.
- 從梳子的一端倒凝膠溶液, 當凝膠到達梳子牙齒時，將模具朝向傾倒端傾斜，以防止氣泡形成.
- 讓凝膠在室溫下固化 1 小時.
- 卸下梳子，在凝膠頂部添加1×TBE緩衝液以覆蓋.
2. 電泳
- 拿 10 μL的PCR產品.
- 添加 10 μL的變性劑 (95% 甲醯胺, 10 MMOL/L EDTA, 0.02% 溴酚藍).
- 添加 30 μL礦物油.
- 煮沸 5 分分鐘, 然後立即放入冰浴中至少放置 2 分分鐘.
- 將整個水相加載到凝膠上.
- 在10-15°C下進行電泳:
- 從300V開始 5 分分鐘.
- 繼續使用120V 8 小時.
- 電泳後, 將凝膠染為1×TBE緩衝液中的凝膠 0.5 μg/ml溴化乙錠 30-45 分分鐘.
- 在紫外線下觀察或進行白銀染色.
3. 銀染
- 用去離子水清洗兩次PAG.
- 將凝膠固定在溶液中 10% 乙醇和 0.5% 乙酸 6 分分鐘.
- 用去離子水清洗兩次.
- 沉浸在 0.2% 硝酸銀 (agno3) 解決方案 10 分分鐘.
- 洗 3-5 用去離子水的時間.
- 在解決方案中發展 1.5% 氫氧化鈉 (Naoh) 和 0.4% 甲醛 7 分分鐘.
- 停止發展 0.75% 碳酸鈉 (NACO3).
SSCP的應用
由於Orita及其同事使用SSCP進行人DNA多態性分析, 該方法已廣泛用於各個領域, 包括檢測與癌症和遺傳疾病有關的基因突變, 以及病毒打字和污染監測.
癌基因突變檢測
- 腫瘤相關的突變:
- SSCP廣泛用於檢測與星形膠質細胞瘤相關的基因中的突變, 腦腫瘤, 小細胞肺癌, 胃癌, 和結直腸癌.
- 它已用於檢測這些腫瘤中p53基因的突變和肺癌的RAS基因突變.
- 成功的應用:
- 最近, Sugano等. 成功使用銀染色的SSCP檢測位置突變 12 C-KI-RAS2基因的, 完成電泳和染色過程 2.5 小時.
遺傳性疾病研究
- SSCP用於研究參與遺傳性疾病的基因，例如:
- 囊腫纖維化: 檢測CFTR基因中的突變.
- 神經纖維瘤病類型 1: 基因突變分析.
- 家族性腺瘤性息肉病: 基因研究與這種情況有關.
- RNA-SSCP vs. DNA-SSCP:
- Sharkar等. 使用RNA-SSCP檢測基因序列 28 血友病患者.
- 與DNA-SSCP和直接基因測序的比較顯示 20 2.6kb因子IX基因中的鹼基突變, 與RNA-SSCP檢測 70% 這些突變與 35% 通過DNA-SSCP檢測, 證明RNA-SSCP的靈敏度較高.
病毒打字和污染監測
- 病毒打字:
- SSCP用於PCR實驗中的病毒鍵入和監測污染.
- YAP使用嵌套的PCR檢測來自不同區域的HBV樣品, 然後進行SSCP分析, 為每個樣品揭示了不同的SSCP模式, 指示HBV DNA的區域變化並消除了交叉污染的可能性.
- 污染監測:
- SSCP是確保PCR診斷結果準確性的可靠方法.
病原體傳播研究
- SSCP用於研究病原體的傳輸途徑.
定量DNA分析
- 乳腺癌細胞分析:
- SSCP, 與競爭性PCR結合, 用於對乳腺癌細胞中突變p53基因的定量分析.
- 該方法的優勢在於使用與目標DNA不同的內部標準的使用, 確保相同的擴增條件，從而更準確.
SSCP的預防措施
SSCP很快, 簡單的, 和檢測基因突變的敏感方法. 獲得最佳結果, 應觀察到以下預防措施:
可重複性:
- 影響SSCP可重複性的主要因素是電泳電壓和溫度. 保持這些條件的恆定確保SSCP模式的重複性良好.
- 一般來說, SSCP圖案顯示兩個單鏈DNA波段, 但是有時由於兩個單鏈DNA分子之間的相似空間構象，可能只出現一個或三個頻段以上. 超過三個頻段的存在可以表明野生型和突變DNA片段的混合物.
目標DNA序列的影響:
- SSCP比在較長的DNA或RNA序列中檢測點突變更有效. 這可能是因為較長分子的單基數變化對維持空間構象的影響較小.
- 一些研究人員認為，對於DNA鏈而言， 400 BP, 長度不影響SSCP的有效性. 仔細選擇實驗條件可以達到過高的檢測率 90% 對於點突變 354 BP DNA片段.
電泳電壓和溫度:
- 保持單鏈DNA的穩定空間構象, SSCP應在較低的溫度下進行 (通常在4°C和15°C之間). 一開始高壓 (250V) 為了 5 分鐘有助於最初具有不同構象的單鏈DNA，而不會顯著升高凝膠溫度. 應之後的電壓較低 (大約100V) 進一步分開鏈.
- 應根據特定的實驗條件確定電泳的精確電壓.
點突變位置的影響:
- 點突變在DNA或RNA中的位置會根據其在保持空間構象中的作用影響SSCP檢測率, 而不是其在鏈上的線性位置.
- 與附近的末端相比，DNA中央區域的突變通常更容易檢測到.
- 然而, 即使中央區域的突變也不明顯改變空間構象，也可能無法檢測到. 例如, 懷特的研究發現只有 2 在......之外 9 檢測到髮夾結構環處的點突變的樣品, 表示檢測率 22%.
解釋SSCP結果:
- SSCP根據空間構象而不是分子量或電荷分離單鏈DNA. 有時, 正常鍊和突變鏈的遷移速率非常接近, 使它們很難區分.
- 通常, 電泳長度 16-18 需要CM根據檢測極限準確確定結果, 這是突變體和正常DNA片段之間最小的可辨別電泳距離差.
- 如果距離大於檢測極限 (例如, 3毫米), 指示突變. 較小的距離表明沒有改變. 設定低檢測限可以導致誤報.
- 其他條件, 例如加載的PCR產品量, PAG交聯的程度, 和凝膠濃度, 應根據特定的實驗要求選擇.
PCR-SSCP的詳細信息按步驟
樣品製備
- PCR擴增和檢測:
- 使用適當的引物進行PCR擴增，然後選擇合適的退火溫度.
- 通過在 2-2.5% 瓊脂糖凝膠通過水平電泳. 載入 3-5 PCR產品的µL.
- PCR產品的最佳濃度應在附近 10 ng/µl.
- 將PCR產品與變性緩衝液混合:
- 添加 5 SSCP樣品緩衝液的µL (軟化緩衝區, 與排序緩衝區相同 “分子克隆”) 到干淨的PCR管的底部.
- 將PCR擴增產品添加到緩衝區的中心. 根據在瓊脂糖凝膠上的頻帶的可見性調整數量:
- 如果樂隊很聰明, 添加 1 微升.
- 如果結果很好, 添加 0.5 微升.
- 如果樂隊不是很清楚, 添加 1.5, 2, 或者 3 相應地.
- 按比例增加樣品緩衝量, 例如, 為了 3 µL PCR產品, 添加 8 µL緩衝液以更好地變性.
- PCR產品的變性:
- 離心管以將樣品集中在底部.
- 將樣品在95°C下變性 10 分鐘使用 PCR機, 然後立即將PCR產品放在冰上 5 防止重新飽和的分鐘.
筆記: 步驟 3 和 4 在等待凝膠凝固的同時，可以在凝膠製備的第四步之後執行.
凝膠製備
- 準備玻璃板:
- 用自來水沖洗每對玻璃板，然後用DDH2O沖洗.
- 用吸收紙幹玻璃板，然後用無水乙醇擦拭.
- 允許乙醇蒸發 2-3 分分鐘.
- 組裝玻璃板，然後將它們放入凝膠鑄台, 確保雙方和底部得到固定.
- 擰緊組件螺釘以保持板的水平. (使用無水乙醇檢查洩漏。)
大凝膠 (50% 甘油濃度)
| 成分 | 8% 凝膠 (10ML下凝膠) | 8% 凝膠 (5ML堆疊凝膠) | 6% 凝膠 (10ML下凝膠) | 6% 凝膠 (5ML堆疊凝膠) |
|---|---|---|---|---|
| 30% 頁 | 2.7毫升 | 1毫升 | ||
| 10× 待定 | 1毫升 | 0.5毫升 | ||
| 50% 甘油 | 1毫升 | 0.5毫升 | ||
| 水 | 5毫升 | 3毫升 | ||
| APS | 70微升 | 70微升 | ||
| 誘惑 | 12微升 | 8微升 | ||
| 總體積 | 10毫升 | 5毫升 |
小凝膠 (50% 甘油濃度)
| 成分 | 8% 凝膠 (15ML下凝膠) | 8% 凝膠 (10ML堆疊凝膠) | 6% 凝膠 (15ML下凝膠) | 6% 凝膠 (10ML堆疊凝膠) |
|---|---|---|---|---|
| 30% 頁 (4℃) | 4.05毫升 | 2毫升 | 2毫升 | |
| 10× 待定 | 1.5毫升 | 1毫升 | 1毫升 | |
| 50% 甘油 | 1.5毫升 | 1毫升 | 1毫升 | |
| 水 | 7.5毫升 | 6毫升 | 6毫升 | |
| APS | 105微升 | 70微升 | 70微升 | |
| 誘惑 | 12微升 | 12微升 | 12微升 | |
| 總體積 | 15毫升 | 10毫升 | 10毫升 | 5毫升 |
凝膠倒
- 混合凝膠: 根據提供的配方准備凝膠溶液後, 徹底混合以確保均勻性.
- 倒入玻璃板: 小心地將準備好的凝膠溶液倒入裝配的玻璃板中. 確保在倒入過程中沒有氣泡被困. 如果觀察到任何氣泡, 輕輕傾斜板以使氣泡升至表面. 輕輕敲擊板的側面可以幫助釋放被困的氣泡.
- 插入梳子: 一旦凝膠溶液水平達到玻璃板頂部邊緣以下約0.5厘米, 將梳子插入凝膠中. 確保在梳子牙齒和凝膠表面之間沒有氣泡. 如果有氣泡, 卸下梳子, 釋放氣泡, 並小心地重新插入梳子.
- 允許凝膠聚合: 插入梳子後, 通過將板放置平坦或略微角度，使凝膠聚合成聚合 (少於 10 度) 在水平表面大約 30 分分鐘. 在這段時間, 凝膠將聚合和凝固.
筆記: 這也是進行PCR樣品變性的合適時機，如步驟中所述 3 和 4 第一部分.
凝膠加載
- 放置凝膠:
- 聚合後立即從凝膠中取出梳子.
- 確保施加武力以維持井的完整性.
- 將凝膠板固定到電泳設備上，井面向內.
- 將凝膠板過渡到電泳緩衝液，以避免大氣泡.
- 電子之前:
- 將1×TBE電泳緩衝液加到上部儲層，直到液位高於玻璃板的較短邊緣約1厘米.
- 確保上層水庫沒有洩漏.
- 將電壓設置為大型設備的140-150V，小型設備為110-120V.
- 大約電子生產前 10 分分鐘.
- 樣品加載:
- 依次將準備好的樣品添加到凝膠的孔中.
- 避免將樣品加載到最接近每個凝膠板邊緣的兩個井中.
- 電泳:
- 將電壓設置為大型設備的140-150V，小型設備為110-120V.
- 在10-15°C的溫度下執行電泳 10 小時.
染色
- 固定:
- 從設備上取下凝膠, 標記起點, 沉浸在 70% 乙醇 15 搖床的幾分鐘.
- 固定後恢復乙醇，然後用蒸餾水兩次沖洗大約 3 每次沖洗分鐘.
- 染色:
- 在染色溶液中染色凝膠 (200ML包含 3.6% NaOH 4.2毫升, 20% AGNO3 3.6毫升, 氨2ml) 為了 30 分分鐘.
- 如果同時染色兩個凝膠，請調整染色時間.
- 發展:
- 開發開發解決方案的凝膠 (200ML包含 1% 檸檬酸鈉1ML, 甲醛100ul) 直到樂隊清晰可見.
- 用蒸餾水沖洗三次 3 分鐘每分鐘以停止開發.
- 或者, 通過將凝膠浸入含有0.5ug/ml溴化乙錠的1×TBE緩衝液中，以染色凝膠 10 分鐘並在紫外線下可視化
公式
10×TBE公式:
- Tris基礎: 108G
- 硼酸: 55G
- 0.5mol/l edta (酸鹼度 8.0), 調整為1L的音量
定性緩衝公式:
- 98% 去離子甲酰胺
- 10MMOL/L EDTA (酸鹼度 8.0)
- 0.025% 二甲醇FF
- 0.025% 溴苯酚藍
筆記:
- 再現性:
- 電泳過程中保持穩定的電壓和溫度是影響SSCP可重複性的主要因素.
- 通常, SSCP圖案顯示兩個單鏈DNA波段, 但是有時只會出現一個或三個或三個或更多樂隊, 可能是由於野生型和突變DNA片段之間存在相似的三維構象.
- 靶DNA序列的影響:
- 與長鏈DNA相比. 這可能是因為長鏈DNA和RNA分子的各個鹼基對維持三維構象的影響較小.
- 在較短的DNA鏈的情況下 (低於400bp), DNA的長度不影響SSCP的有效性.
- 電泳電壓和溫度的影響:
- 維持單鏈DNA的穩定的三維構象, SSCP應在較低的溫度下進行 (通常在4°C和15°C之間).
- 電泳過程中, 過量電壓會導致溫度升高. 所以, 在沒有冷卻裝置的電泳罐中執行SSCP時, 更高的電壓 (250V) 最初應使用, 然後將電泳降低至約100V.
- SSCP結果的解釋:
- 在SSCP分析中, 單鏈DNA片段的分離是基於其空間障礙的大小而不是分子量, 因此無法反映分子量.
- 結果解釋應基於檢測極限, 這是指突變體和正常DNA片段之間的電泳距離的最小差異，可以區分這些片段.
- 其他考慮因素:
- 諸如PCR產品的量, 聚丙烯酰胺凝膠的交聯密度, 並且應根據特定的實驗條件選擇和確定凝膠的濃度.
