什麼是原位 PCR? 它有什麼用?

現場 聚合酶鍊式反應, 或原位聚合酶鍊式反應, 是科學研究中使用的技術. 科學開發的每種新技術都會提出一系列新的研究結果, 從而推動各種學科的進步.

原位PCR的發展

• 在1950年代, 將電子顯微鏡引入形態學觀察結果，從細胞水平到亞細胞水平進行了深入的研究.
• 在 20 世紀 60 年代和 1970 年代, 免疫組織化學和免疫細胞化學技術的廣泛應用將觀察結果從亞細胞結構推向蛋白質分子水平, 允許在細胞內或在亞細胞水平上定位許多活性物質, 深刻影響醫學生物學的發展.
• 在1970年代, 分子生物學技術在形態學中的廣泛應用, 以及現場雜交技術的出現, 啟用了組織細胞中特定DNA或RNA序列的定位, 從蛋白質到遺傳水平提高觀察和定位水平, 即核酸分子. 這種在遺傳水平上對許多生物學現象的人類理解加深了.
• 1980年代, 聚合酶鍊式反應 (聚合酶鍊式反應), 分子生物學領域的強大至關重要的技術, 出現了. 它很快被引入形態觀察領域, 可以在細胞內使用低拷貝數或單個副本的特定DNA或RNA進行定位和觀察. 該技術的出現必然會帶來更多的研究發現, 大步向前推動形態學研究.

原位PCR的原理

• 基本原理: 原位PCR結合了PCR的高效擴增與原位雜交的細胞定位，以檢測組織細胞內的特定DNA或RNA序列.
• PCR技術: 利用DNA聚合酶通過變性擴增特定的靶序列, 退火, 和擴展週期, 導致高度敏感和特定的擴增.
• 傳統PCR的局限性: 傳統PCR是在液相進行的, 在擴增之前需要細胞破壞和核酸提取, 將PCR結果與細胞形態相關聯並確定包含特定靶序列的細胞類型，使其具有挑戰性.
• 原位PCR的優點: 結合了PCR和原位雜交技術的優勢，同時克服了它們各自的局限性.
• 程式: 組織樣品是化學固定的，以維持細胞形態. 細胞和核膜的滲透性使PCR成分進入細胞或核, 它們放大原位固定的RNA或DNA. 放大產品, 通常是大分子或交織結構, 原位保留並通過原位雜交輕鬆檢測.
• 好處: 實現細胞內特定DNA或RNA序列的指數擴增, 通過原位雜交促進其檢測.

基本類型 原位PCR

原位PCR技術可以分為兩種主要類型: 直接方法和間接方法, 根據三磷酸核苷酸或擴增反應中使用的引物是否被標記. 另外, 有逆轉錄原位PCR技術.

直接方法原位PCR技術:

• 在直接方法中, 放大產物直接用標記分子標記, 例如標記的三磷酸腺苷或底漆片段. 在樣品的PCR擴增過程中, 標記的分子被納入擴增產物, 啟用標本中特定DNA或RNA的可視化 (現場).
• 常見標記包括35s等放射性同位素, 生物素, 和地高辛. 這些標記’ 可以使用諸如放射性同位素放射自顯影或親和組織化學和生物素的免疫組織化學等方法檢測到位置。.
• 直接方法的優點包括簡單性, 較短的處理時間, 和易於操作. 然而, 它的缺點，例如較低的特異性, 假陽性的可能性更高, 並降低擴增效率, 尤其是在切片中DNA損傷可能導致誤報的石蠟部分.
• 間接方法原位PCR技術:

間接方法原位PCR技術:

• 在間接方法中, 首先在細胞內執行特定的DNA或RNA擴增, 然後使用標記的探針進行原位雜交, 顯著提高特異性. 它目前是最廣泛使用的原位PCR技術.
• 與直接方法不同, 反應系統類似於常規PCR, 沒有標記的引物或三磷酸腺苷使用. 目的是首先放大, 然後檢測使用原位雜交技術在細胞中擴增的特定DNA產物. 它有效地結合了PCR和原位雜交技術, 也稱為PCR原位雜交 (烹飪).
• 間接方法的優點包括更高的特異性和擴增效率, 但它涉及比直接方法更複雜的操作步驟.

原位逆轉錄PCR技術:

• 原位逆轉錄PCR (原位RT-PCR) 是一種將液相RT-PCR技術應用於組織細胞樣品的新技術. 與液相RT-PCR不同, 在原位逆轉錄PCR之前，用DNA酶處理組織樣品以破壞組織DNA, 確保放大模板是從mRNA合成的cDNA, 不是細胞中的原始DNA. 其他基本步驟類似於液相RT-PCR.

如何運行原位PCR測試?

原位PCR技術的基本步驟包括樣品準備, 原位放大 (聚合酶鍊式反應), 和原位檢測, 如下所示 (專注於石蠟部分):

樣品製備:

• 原位PCR技術可以應用於細胞懸浮液, 細胞塗片, 冰凍切片, 和石蠟切片.
• 與其他方法相比, 原位PCR可以通過懸浮完整的細胞產生最佳結果, 石蠟切片產生最差的結果.
• 表現不佳的一些原因包括:
  • 在載玻片上進行PCR時，導熱率差和熱對流不平坦.
  • TAQ DNA酶吸附到載玻片上.
  • 樣品處理後, 細胞缺乏完整的細胞質或核膜, 導致擴增產物的擴散並難以在原位保留它們.
• 大多數病理標本都用福爾馬林固定並保存在石蠟中.
• 解決與石蠟部分的原位PCR有關的技術問題將非常重要.

組織細胞固定: 通常用 10% 緩衝福馬林或 4% 多聚甲醛可更好地導致原位PCR. 固定時間不應太長, 通常 4-6 4°C 小時.

切片厚度: 較厚的切片通常在原位PCR中產生更好的結果，因為它們包含更多的靶DNA和膜結構, 防止擴增產​​品的擴散. 然而, 較厚的切片可能導致更多的細胞重疊和形態觀察的分辨率降低.

載玻片處理: 為了防止在PCR和原位雜交期間石蠟切片脫離, 幻燈片應進行處理以防止脫離. 常見方法包括用聚-L賴氨酸或矽烷化處理塗層, 通常可以防止組織脫離.

蛋白酶消化:

原位放大 (聚合酶鍊式反應): 原位擴增涉及在組織細胞樣品上進行PCR反應, 基本原理與液相PCR相同. PCR中使用的引物通常為15-30bp, 放大的片段約為100-1000bp.

反應系統:

• 原位PCR的反應系統與常規液相PCR相似.
• 較高的底漆, TaqDNA聚合酶, 與液相PCR系統相比.
• 牛血清白蛋白 (牛血清白蛋白) 應添加到反應系統中，以防止TAQ DNA聚合酶與載玻片結合併降低擴增效率.

熱循環:

• 可用於原位PCR的熱循環可以在專門的熱循環儀或常規PCR熱循環儀中進行.
• 原位PCR熱循環的每個步驟可能比常規PCR稍長，以確保足夠的擴增.
• 可以採用熱門方法來最大程度地減少熱循環期間反應系統的損失.

洗滌:

• 現場放大後, 樣品應洗滌以去除散佈外部細胞的放大產品.
• 洗滌不足可能會導致檢測過程中放大產物的可視化, 導致過度黑暗的背景或假陽性結果.
• 過度洗滌也可能導致細胞內部的放大產物去除, 削弱或失去正信號.

固定後: 一些作者報告了使用 4% 多聚甲醛用於 2 小時或 2% 戊二醛用於 5 放大後的固定後分鐘，以確保在檢測過程中將放大產物及格保留在細胞中, 從而提高檢測的靈敏度和特異性.

原位檢測: 檢測原位PCR擴增產物的方法取決於原位PCR協議的設計. 直接方法基於標記分子的性質直接檢測放大的產物, 雖然間接方法需要通過原位雜交檢測.

原位PCR的應用

外源基因檢測

• 檢測病毒基因:
  • 在感染病毒的細胞中, 檢測可能具有挑戰性. 然而, 原位PCR為解決這個困難提供了希望.
  • 原位PCR已成功地用於觀察各種病毒（例如HIV）的作用, HPV病毒, 單純皰疹病毒, B型肝炎病毒, 丙型肝炎病毒, ETC。, 在艾滋病等條件下, 生殖系統腫瘤, 肝炎, 和肝癌, 啟用及時確定感染者.
• 檢測細菌基因:
  • 一個突出的應用是檢測結核分枝桿菌. 當結核病灶不典型時, 使用特殊的染色方法鑑定顯微鏡下的細菌很具有挑戰性. 原位PCR可以幫助做出明確的診斷, 即使結核分枝桿菌的存在也很小.
• 檢測進口基因:
  • 在研究轉基因動物, 基因進口的確認, 以及接受基因治療的患者, 可以使用原位PCR驗證. 因此, 原位PCR已成為一種重要的檢測方法.

內源基因檢測

異常基因檢測:

• 突變和重排檢測:
  • 原位PCR能夠檢測體內基因的突變和重排.
  • 原始基因和腫瘤抑制基因的突變, 以及免疫球蛋白重鏈基因的重排, 是使用原位PCR檢測到的遺傳改變的示例.
• 在癌症研究和診斷中的應用:
  • 這些突變和重排在癌症發展和進展中起著至關重要的作用.
  • 原位PCR通過精確檢測這些遺傳改變，在癌症研究和診斷中提供廣泛的應用.
  • 它促進了對癌症基礎機制的理解，並有助於開發目標療法.

構成基因的檢測:

• 低級基因表達的挑戰:
  • 在低水平表達的本構基因對檢測方法構成挑戰.
  • 由於人體細胞中的基因拷貝數有限，原位雜交技術無效.
• 液相PCR的局限性:
  • 液相PCR可以放大和檢測低級基因，但缺乏細胞類型特異性.
  • 它無法準確確定哪種細胞類型包含靶基因.
• 原位PCR的優點:
  • 原位PCR克服了這些限制.
  • 它可以檢測各種人類基因, 甚至那些以低水平表達的人.
  • 原位PCR通過在特定細胞類型中提供準確的基因定位來促進人類基因圖的完成.