介紹
- AFLP是一種DNA分子標記技術，透過限制限制性內切酶產生的片段長度來檢測DNA多態性.
- AFLP技術的主要特點是:
- 需要少量 DNA 進行分析, 僅0.5克.
- 表現出良好的再現性.
- 表現出強烈的多態性.
- 提供高解析度.
- 不需要Southern雜交.
- 適用於多種樣品.
- 表現出穩定的遺傳性.
- 從技術特點來看, AFLP是RAPD和RFLP結合的產品.
- 克服了RFLP技術複雜性和放射性危害的缺點, 以及 RAPD 中遺傳標記的不穩定性和優勢，同時結合了兩者的優點.
- 最近幾年, 這項技術不斷改進和發展, 使 AFLP 迅速成為迄今為止最有效的分子方法.
AFLP原理
- AFLP也是一種DNA分子標記技術，透過限制限制性內切酶產生的片段長度來檢測DNA多態性.
- 然而, AFLP 涉及透過以下方式擴增酶切片段： 聚合酶鍊式反應 先反應, 然後將擴增的酶切片段在高解析度定序凝膠上進行電泳. 根據擴增片段長度的不同檢測多態性.
- 實驗中, 首先將酶切片段連接到含有相容黏性末端的人工接頭上. 這些銜接末端的順序, 連同接頭序列, 作為後續 PCR 反應的結合位點.
- 根據要求, 不同的引子 1 到 3 末端添加選擇性核苷酸可用於實現選擇性擴增. 這些選擇性核苷酸使引子能夠選擇性地識別具有特定配對序列的酶切片段, 導致特異性擴增.
測試所用試劑
| 實驗試劑 | 描述 |
|---|---|
| Taq酶 | DNA聚合酶 |
| EcoRI/MseI 轉接器 | 限制性內切酶接頭 |
| E+A引子 | PCR 擴增引子 |
| M+C 引子 | PCR 擴增引子 |
| T4 DNA 連接酶 | DNA連接酶 |
| E和M寡核苷酸 | PCR 寡核苷酸 |
| 瓊脂糖 | 電泳用凝膠基質 |
| 過硫酸銨 | 凝膠注模和 DNA 變性催化劑 |
| 丙烯醯胺 | 用於高解析度測序的凝膠基質成分 |
| 尿素 | 電泳變性劑 |
| 硝酸銀 | 用於可視化 DNA 帶的染色 |
| 甲醯胺 | DNA定序凝膠變性劑 |
| dNTP | 用於 PCR 的脫氧核苷酸三磷酸 |
| 二甲苯氰 | 電泳示蹤染料 |
| 醋酸 | 用於凝膠製備 |
| 玻璃矽烷 | 凝膠電泳玻璃板塗層劑 |
| 50BP標記 | DNA 標記 50 鹼基對大小參考 |
實驗過程
1. 基因組 DNA 萃取與純化
參考DNA萃取方法.
- DNA 片段的電泳 0.8% 瓊脂糖凝膠 (含0.5μg/ml溴化乙錠, EB), 取出 1/3 萃取的基因組DNA用於純化.
- 首先, 以 TE 緩衝液補充萃取的 DNA 的體積至總體積 50 微升.
- 用苯酚/氯仿/異戊醇萃取一次 (25:24:1) 並用氯仿/異戊醇一次 (24:1). 離心並將上清液轉移至 Eppendorf 管中.
- 添加 1/10 體積的 NaAc 和兩倍體積的預冷無水乙醇, 並在-20°C下放置至少 2 小時. 10,000g 離心 10 分分鐘.
- 將 DNA 沉澱物洗滌兩次 70% 乙醇, 風乾, 並溶解在 30 µl TE 緩衝液.
- 使用 UV-2401PC 測量 A260 和 A280 值 (島津) 用於定量的紫外線分光光度計.
- DNA 片段的電泳 0.8% 瓊脂糖凝膠 (含0.5μg/ml EB) 用於尺寸確定.
筆記:
- 適用於0.1-0.2g組織, 溶於100μl溶液E中. 適用於0.5g紙巾, 將溶液 E 加入至 300μl. 在此刻, DNA濃度約100ng/μl.
2. 限制性酶切和連接
在0.2ml離心管中, 添加:
- 約250ng模板DNA,
- 2.5μl 10×限制性內切酶消化緩衝液,
- 2.5µl 10× T4 DNA 連接酶緩衝液,
- 5 EcoRI 單位,
- 5 MseI 單位,
- 2 T4 DNA 連接酶單位,
- 50pmol MseI 適配器,
- 雙蒸水至總體積25μl.
將混合物在設定為 37°C 的 PCR 熱循環儀中孵育過夜. 消化後, 透過在 65°C 下孵育來滅活酶 20 分分鐘. 將反應儲存在 -20°C 下以進一步用作預擴增模板.
3. 前置放大
取酶切連接產物3μl，加入:
- 75E+A底漆的,
- 75M+C引子,
- 15毫米鎂2+,
- 25mM dNTP,
- 1 的單位 Taq聚合酶,
- 3µl 10× PCR 緩衝液,
- 加雙蒸水至總體積30μl.
PCR反應參數設定如下:
- 94°C 初始變性 90 秒,
- 94°C 變性 30 秒,
- 56°C 退火 1 分分鐘,
- 72°C 延伸 1 分分鐘,
- 重複以上步驟 30 週期,
- 最終延伸溫度為 72°C 10 分分鐘 (使用 PCR機 來自PE公司).
反應後, 透過電泳分析擴增產物 0.8% 瓊脂糖凝膠 (含0.5μg/ml EB). 取本品3μl，稀釋 50 進一步用作選擇性擴增模板的時間.
4. 選擇性 PCR 擴增
取稀釋後的產品3μl，加入:
- 75EcoRⅠ選擇性引子的製備,
- 75MseⅠ選擇性引子的製備,
- 15毫米鎂2+,
- 25mM dNTP,
- 1 Taq聚合酶單位,
- 3µl 10× PCR 緩衝液,
- 加雙蒸水至總體積30μl.
PCR反應參數設定如下:
- 94°C 初始變性 90 秒,
- 94°C 變性 30 秒,
- 65°C 退火 1 分分鐘, 然後執行 13 週期 (每個週期降低溫度 0.7°C),
- 94°C 變性 30 秒,
- 56°C 退火 1 分分鐘,
- 72°C 延伸 1 分分鐘, 然後執行 25 週期,
- 最終延伸溫度為 72°C 5 分分鐘 (使用PE公司的PCR儀).
第一的, 透過電泳分析選擇性擴增產物 0.8% 瓊脂糖凝膠 (含0.5μg/ml EB).
5. 凝膠電泳
使用分離器分離擴增產物 6% 變性聚丙烯醯胺凝膠 (0.5毫米厚度) 和 1× TBE 電泳緩衝液 (BIO-RAD定序電泳儀).
- 取下梳子並以 140W 的恆定功率預運行凝膠 30 分鐘直到溫度達到 47-49°C. 確保洗掉每口井中的尿素.
- 對於選擇性擴增產物, 加入等體積的上樣緩衝液 (98% 甲醯胺, 10毫米乙二胺四乙酸, 0.25% 二甲苯氰, 0.25% 溴酚藍) 並在 94°C 變性 5 分分鐘 (使用PE公司的PCR儀). 變性後, 快速置於冰上直至裝載.
- 將每個樣品 8μl 加載到每個泳道中. 最初, 以 100W 的恆定功率運行凝膠約 2 分鐘快速將樣品濃縮在孔底部. 然後調節至60W恆定功率, 保持溫度在43°C左右, 直至溴酚藍達到約 2/3 凝膠頂部到玻璃板的距離. 結束電泳.
6. 銀染
- 固定方案: 將100ml冰醋酸加入900ml去離子水或雙蒸水中.
- 染色液: 將 1g AgNO3 溶於 1L 去離子水中, 然後加 1.5 毫升 37% 甲醛.
- 開發解決方案: 溶解30克Na2CO3, 1.5 毫升 37% 甲醛, 1L去離子水中2mg硫代硫酸鈉.
- 電泳後, 將裝有凝膠的玻璃板放入塑膠托盤中進行銀染.
- 固定: 加入固定液並在搖床上輕輕搖動 30 分分鐘. 固定後保留固定液.
- 漂洗: 用去離子水清洗凝膠 3 次 2 每次幾分鐘.
- 染色: 將凝膠放入染色盤中，倒入染色液 (保存在4°C). 在搖床上輕輕搖晃 30 分分鐘. 用去離子水沖洗凝膠後 10 秒, 將其轉移到顯影托盤上.
- 發展: 加入顯影液 (保存在4°C) 輕輕搖晃至條帶停止增加.
- 終止: 加入步驟中使用的固定溶液 2 攪拌幾分鐘. 達到最佳效果後，用蒸餾水沖洗幾分鐘.
- 除去凝膠和玻璃板上的水滴後, 將其放在燈箱上並使用尼康數位相機拍攝.
概括
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